分秒必争 感控支柱 | CRE流行病学和实验室检测进展

文章内容整理自北京大学人民医院检验科 王辉 教授的专题讲座

面对不断增长的抗生素耐药性，2017年，世界卫生组织公布了未来诊断产品抗菌药物研发中需要密切关注的12种AMR（耐药）病原菌清单，列在关键级别的均为碳青霉烯耐药的革兰氏阴性菌。

研究表明，在2007年到2016年的十年间，引起血流感染的病原菌中，排在首位的是大肠埃希菌，第二位是肺炎克雷伯菌。据CRE network（中国CRE的疾病负担和病死率研究）数据显示，在国内1万个出院患者中，CRE（碳青霉烯耐药肠杆菌）的总发生率为4.0人，不同地区CRE的发生率存在差异（江苏为14.97人、青海0.34人），83%的患者存在基础疾病，而下呼吸道感染是最主要的感染类型，CRE的死亡率约为33.5%，其中血流感染病死率达43.1%。

2011年到2019年，在28个城市84个中心的5704例CRE菌株中，肺炎克雷伯菌（CRKP）对碳青霉烯耐药的比例在逐渐上升，到2019年几乎达到80%，位居其次的大肠埃希菌仅占10%左右。

2019年，全国9个省市18家医院的208例CRE血流感染数据显示，恰当的抗菌药物治疗预后优于不恰当的抗菌药物治疗；抗菌药物单药治疗和联合治疗的预后没有明显差异。替加环素和粘菌素联合治疗，30天死亡率为46.2%，发生脓毒症或脓毒症休克的概率为59.6%（124/208），30天病死率为60.5%（75/124）。

CRE血流感染危险因素分析

ST11型与KL64 型CRKP（碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌）血流感染患者的脓毒症和感染性休克发生率更高。研究将病例分为septic shock（感染性休克）和non-sepsis（非脓毒症）两组，应用替加环素治疗血流感染的患者愈后较差。而多粘菌素、替加环素以及头孢他啶－阿维巴坦作为国内常用的抗生素，其治疗效果亦并非十全十美。多粘菌素治疗效果一般，替加环素对绿脓杆菌没有任何效果，对鲍曼不动杆菌也没有效果，酶抑制剂的药物对嗜麦芽窄食单胞菌几乎没有效果。

肺炎克雷伯菌对各类抗菌药物的药敏情况也存在较大差异，其中，碳青霉烯类耐药的比例较高，喹诺酮类药物、头孢西丁、头孢他啶、头孢曲松还有酶抑制剂药物等敏感性均不高。

从粘菌素治疗结局（肠杆菌目）来看，对照粘菌素其他药物组（包括粘菌素加美洛培南、酶抑制剂的一些药物）病死率相对较高。所以，从临床的治疗结局来看，体外敏感性比较好，体内效果、30天病死率以及临床的结局较差。

不同地区CRE菌株中CPO（产碳青霉烯酶菌株）的占比也存在差异，全国发现碳青霉烯酶的菌株比例非常高，平均值达到了72.9%。

把CRE菌株分成肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。肺炎克雷伯菌中，KPC酶的比例相对较高，可达到84%以上；在大肠埃希菌中金属酶NDM-5/NDM-1的比例较高，达到88%左右。两种酶类型用药策略不同，特别是碳青霉烯类的酶抑制剂药物的使用并不相同。CHINET的研究数据显示，儿童组有非常明显的NDM菌株，较成人有非常大的区别，成人组以KPC为主，NDM也不容忽视。

在对mcr-1基因的原始祖先、传播的时间以及进化机制进行系统研究后，数据显示，K64和K47相同的血清型聚为了一个cluster（集群），同时携带很多毒力基因，这提醒我们关注肺炎克雷伯菌出现高毒和高耐药性。

肺炎克雷伯菌有两种类型，一种是经典型，另一种是高毒型。经典型是碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌CRKP，以ST11型为主；高毒肺炎克雷伯菌是HvKP，它的夹膜很厚，会产生很多涉铁的因素，以ST23型为主。近两年的趋势为ST11型和ST23型可以发生交融，ST11型获得耐药毒力质粒，ST23型获得耐药质粒，变成CR-HvKP，也就是碳青霉烯耐药、高毒的肺炎克雷伯菌。CRKP中的毒力菌株流行率显著增加，2015年到2017年，毒力菌株的比例从2%增加到了8.1%，而它的适应性未明显降低，其传播风险很高。

重建产KPC的ST11型CRKP的院内传播轨迹

在院内开展的CRKP监测显示，分离出的82株菌株ST11-CRKP沿着三个方向进化，进化率为每年每位点3.4*10-6替换，ICU是CRKP在患者间直接传播的关键场所，医务人员和医疗设备或是传播媒介。

CRKP的菌株里带两种不同的酶：KPC和NDM，酶抑制剂阿维巴坦对KPC酶有效，但对金属酶NDM无效。双产酶CRKP对美罗培南等多种抗生素耐药水平高，双产酶菌株的适应性没有降低，稳定性较高且可以共存。

双产酶的菌株是如何获得的？研究发现，NDM质粒相对较小，速度谱较广，而KPC质粒比较大。进一步对公共数据库的一些菌株进行生信分析发现，双阳菌株的进化轨迹是先获得KPC再获得NDM，而NDM可以在不同的菌种中进行穿梭。

耐药质粒和毒力质粒杂交后变成一个质粒。质粒分成了三个区，两个跟毒力有关的区耐药。质粒通过IS介导转座机制形成，提高了宿主菌的荚膜产量和毒力水平。

中日友好医院的一项研究显示，在对KPC的治疗过程中，四位患者用了头孢他啶/阿维巴坦之后发生四个位点突变，分别突变为KPC-51、KPC-52和KPC-33等。头孢他啶/阿维巴坦的MIC（最低抑菌浓度）升得很高，达到2048。发生突变的同时，对美洛培南和亚胺培南的敏感性稍微降低。一个KPC的菌株对阿维巴坦耐药之后，可能发生适应性的变化，对碳青霉烯的敏感性会提高。KPC的高表达量和拷贝数的增加可以导致头孢他啶/阿维巴坦耐药。

CRE Network系统的研究了1158株CRE药敏结果，总体而言，特定菌株的药敏呈现结果存在明显差异：头孢他啶/阿维巴坦的敏感性为66.7%；肺炎克雷伯菌主要以KPC为主，敏感性为81.3%；大肠埃希菌以NDM为主，敏感性比较差，为32%；阴沟肠杆菌以NDM型为主，头孢他啶/阿维巴坦敏感性非常差，仅为19.4%；替加环素敏感性在90%～98%左右，粘菌素体外表现理想，敏感性达到91%～95%；阴沟肠杆菌稍差；氨曲南+阿维巴坦敏感性非常理想，达到98.3%～100%。本组数据对于临床医生经验性地选择抗菌药物具有指导作用。

头孢地尔是铁载体菌素，研究数据显示肺炎克雷伯菌敏感性达到96.7%；阴沟肠杆菌达到98.1%；但是对于181株大肠埃希菌来说，它的敏感性只有85.1%，出现了14.9%的耐药菌株，MIC均比较高，达到64μg/ml。头孢地尔主要耐药菌株出现在大肠埃希菌，MIC相对水平较高，这类菌株来自多个地区的，这些地区的菌株主要以产生NDM-5为主，ST-167型占主导地位。在研究该药整体耐药机制时，发现铁载体受体的基因CirA的终止编码介导头孢地尔的耐药。

tmexCD-toprJ基因簇的发现和起源

CRE流行病学发现个别菌株同时含有质粒介导的替加环素的耐药基因。通过分析替加环素耐药菌株之间基因组差别，锁定质粒介导的RND型外排泵tmexCD-toprJ，质粒介导的替加环素耐药tmexCD-toprJ外排泵与mcr-8.5共质粒，且通过tn5393转移。该质粒一次传播可以造成替加环素和粘菌素同时耐药。个别菌株在NDM的位置还会合并产生另外一个质粒上，两个质粒可以共存在同一菌株。

在临床菌株中也会有特殊情况，通过质粒外排泵的进化机制发现外排系统来自绿脓杆菌等染色体，其传播性明显增加。外排系统转移的谱型和转移机制是tmexCD-toprJ的发现和起源。截取tmexCD-toprJ上下游各20k片段寻找核心基因SNPs突变，利用贝叶斯模型联合生物钟构建系统发育树，发现它是由气单胞菌或者假单胞菌传给肺炎克雷伯菌，大概发生时间在2000年到2010年，基因素的形成在1991年左右。

CRE库出现替加环素不敏感，产生IMP-4、K2-ST65、CR-hvKP，在肺炎克雷伯菌中表现非常复杂，伴随着高毒高耐药。替加环素耐药是质粒介导，粘菌素耐药也是质粒介导。IMP-4、K2-ST65引起了严重的致死性感染，其中一株替加环素不敏感是由TetR/AcrR家族转录调节因子移码突变造成。

K2-ST65都是NDM/KPC的，那么IMP-4从哪来呢？此前日本曾经进行过报道，但未表明它能够转到hvKP中。通过进一步分析，对所有菌株进行研究发现IMP-4的基因环境、专一单元和之前的某些菌株比较相似。其他研究显示，在替加环素压力下可以诱导CR-hvKP中粘菌素的耐药性，也就是一个药的使用可能会诱导出另一个药的耐药性，究其原因是染色体上mgrB周围～4.4kb的缺失，这是值得关注的问题和风险。

CRE已经成为临床面临的重要挑战，BSI中CRE的病死率较高，传播较快。产酶是细菌耐药的主要机制，其中KPC、NDM最重要，双阳比例在增加，这对于实验室检测提出了挑战；肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是有差异的，成人和儿童的酶型也是有区别的。高度关注肺炎克雷伯菌的高毒和高耐药菌株，关注头孢他啶/阿维巴坦在使用中可能出现的耐药现象，同时关注大肠埃希菌也出现了高耐药。临床用药时需注意出现复杂的质粒介导耐药机制，包括mcr粘菌素可转移的耐药基因，外排系统的替加环素耐药的基因组合，这将是临床面临的一项挑战。