一.文库类型
转录组文库构建的时候，可以选择链特异性文库或非链特异性文库。
链特异性文库，我们清楚的知道得到的 reads 跟转录本是同向的还是反向的。
链特异性文库构建，有多种方法，最常用的就是基于 dUTP 的方法。
文库类型有两种表示方法。
| 第一种表示法 | 第二种表示法(PE) | 第二种表示法(SE) | 建库方法 |
|---|
| fr-unstranded | 无 | 无 | Standard Illumina |
| fr-firststrand | RF | R | dUTP, NSR, NNSR |
| fr-secondstrand | FR | F | Ligation, Standard SOLiD |
第一种表示方法：
第二种表示方法：
二.参数设置
在数据分析中，最复杂、最容易出错、出错了影响最为严重的除了用错书记，就是搞错文库类型参数了。设置错了可能导致转录本很短、表达量极低、比对率极低等。在数据分析的时候，一定要问清楚构建文库的实验人员。
常用软件的参数设置如下。
1. 转录本拼接软件
在进行转录本拼接的时候，需要考虑链特异性的问题。
1.1 Trinity
- 非链特异性 默认，不需要设置
- 链特异性 参数为：—SS_lib_type ，如果使用dUTP，值为 RF
1.2 cufflinks
- 非链特异性 —library-type fr-unstranded, 默认
- 链特异性 如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand
2. 将 reads 比对到基因组的软件
2.1 tophat
- 非链特异性 —library-type fr-unstranded, 默认
- 链特异性 如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand
2.2 hisat2
- 非链特异性 默认，不需要设置
- 链特异性 如果使用dUTP: —rna-strandness RF， 添加了该参数后，每条 reads 将在 sam 文件中出现 XS 的tag，‘+’ ‘-’ 代表该 reads 所在的转录本与基因组序列的关系。
2.3 STAR
STAR 的比对中，不需要手动设置文库类型的参数。
3.表达定量
表达定量软件根据比对的 sam 文件，计算 read counts，需要提供链特异性信息。
3.1 eXpress
- 非连特异性 默认，不需要设置
- 链特异性 如果使用dUTP：—rf-stranded
3.2 RSEM
RSEM 使用 --strandedness 参数设置 。
- 非链特异性 --strandedness none
- 链特异性 如果使用dUTP: --strandedness reverse
本文来自 基因课，生物信息视频课程，每周更新。
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