解螺旋公众号·陪伴你科研的第2236天
大家好，我是风。有肿瘤研究方向的学员来问我，能不能为新人来详细分析一篇肿瘤研究的零代码生信文章，今天这篇Identification of Therapeutic Targets and Prognostic Biomarkers Among CXC Chemokines in the Renal Cell Carcinoma Microenvironment不知道合不合你们胃口。会了代码的学员可能会不喜欢这种零代码的文章，认为用上代码都发不了好文章，还零代码？你这种想法从某种角度来说也没错，毕竟如果纯生信10+的文章，那不上代码可能不行，但是找个好的切入点，利用各种数据库零代码解决“温饱”，应该还是可以的。这篇文章是2020年发表在Frontiers in Oncology，IF为4.137，实时IF 4.99，估计今年上5分是没问题了。
先看题目
一样我们先来看下题目，疾病为肾癌，问题一样是寻找预后靶点和标志物：
从题目就可以看出来，这又是一个基因家族的分析，对于这种文章，分子的选择就非常关键了。不要拘泥于基因家族，你也可以选择某条通路的基因或者某一条通路一个分支上的基因。当然啦，分子新颖性和经典性也要考虑。除了这种多个基因单肿瘤的分析，你也可以选择一个分子，然后单基因泛肿瘤分析，这个很容易可以想到对吧？在线工具门槛低，所以提出问题和设计故事就非常重要了。肾细胞癌背景知识不复杂，使用到的工具有：ONCOMINE, GEPIA, UALCAN, cBioPortal, GeneMANIA, DAVID 6.8, Metascape, TRRUST, LinkedOmics和TIMER，都是我们熟悉的工具吧？
再看内容
挑
作者先是使用Oncomine数据库评价CXC趋化因子在肾癌中的表达，采用阈值为FC>2，p<0.05，rank为top10，结果显示在癌组织中CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL16的转录水平显著高于正常肾组织，而CXCL3、CXCL7和CXCL13的转录水平显著低于正常肾组织（作者在展示这个结果的时候就开始引用文献讨论结果的可靠性，emmmm，我觉得见仁见智，放在讨论部分阐述可能会更好）。为了验证结果的可靠性，作者还用UALCAN验证了CXC家族在肾癌中的表达。（Figure 1-3）
▲Figure 1 Oncomine
▲Figure 2 UALCAN
▲Figure 3（作者并没有交代Figure 3是怎么画出来的，但是GEPIA可以达到这样的效果）
靠
接下来作者转到了临床意义部分，即使用GEPIA分析CXC和肾癌临床病理参数之间的关系。结果表示随着肿瘤进展，CXC1、CXC5、CXC9、CXC10、CXC11和CXC13的表达增加，这些数据表明这些CXC趋化因子在肾癌的发生和发展中起着重要作用。
▲Figure GEPIA
还没结束，作者趁热打铁，既然分析了CXC表达与肾癌分期之间的关系，那接着再分析一下这些分子的预后作用，很合理吧？所以接下来还是使用GEPIA分析CXC趋化因子在肾癌进展中的预后价值，主要分析了无病生存期（DFS）和总生存期（OS），结果发现CXCL1和CXCL5的表达与较长的无病生存期有关，而CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5和CXCL13的低转录水平与较长的总生存期显著相关。
▲Figure 5 GEPIA
▲Figure 6 GEPIA
联
接着作者转到分子交互部分，使用cBioportal对肾癌中的CXC家族成员基因突变进行分析，同时利用TCGA数据，分析了CXC成员表达之间的相关性，结果发现CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5之间的相关性较强。此外，作者还使用STRING数据库对差异表达的CXC趋化因子进行了PPI网络分析，以探索它们之间的潜在相互作用，并GeneMANIA探索它们之间的可能参与的通路与功能（这个你们很少用吧？）最后使用cBioportal分析CXC分子与50个最相关的邻近基因的关系（cBioportal这个功能好像已经消失了，可以用其他数据库补上这部分分析）：
▲Figure 7 cBioportal+GeneMANIA
圈
前面作者找到了CXC差异基因的50个邻近基因，接着使用DAVID和metascape对这些分子进行功能聚类，也就是GO和KEGG，结果显示在KEGG中，趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的通路、病毒致癌途径、RAS信号通路、癌症中的蛋白多糖、白细胞跨内皮细胞迁移和RAP1信号通路与肾癌的发生和发展密切相关。
▲Figure 8 DAVID
挑圈联靠一套打完，各位看官先别急着走，主线走完了，我们来看看作者还进行了哪些支线内容：
联：（拓展性的联）作者利用TRRUST和LinkedOmics数据库探索了差异表达的CXC趋化因子的可能转录因子靶点和激酶靶点，结果发现有三个转录因子(RELA、NFKB1和SP1)与CXC趋化因子的调节有关。RelA和NFKB1是CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL10和CXCL12的关键转录因子，SP1是CXCL1和CXCL5的关键转录因子。具体结果展示如下：
▲Table 2 TRRUST
▲Table 3 LinkedOmics
接着作者认为肾癌中CXC趋化因子的免疫细胞浸润参与了炎症反应和免疫细胞浸润，从而影响肾癌患者的临床转归，所以利用TIMER数据库对差异表达的CXC趋化因子与免疫细胞浸润的相关性进行分析，后面就是描述一下TIMER的结果了：
▲Table 9 TIMER
这样文章整套走完，其实套路来说相对简单，类似的套路还有在生信全书第四段位讲解的范文，目前来说这种基因家族的分析，只要文章故事组织的好，发表的可能性还是很大的，就看你能加多少支线内容并且构成一个好故事了。
生信只是一种工具，不管是代码也好，在线工具也罢，能够为我们的科研服务才是好工具，生信就像是一个大综述，一个有理有据带有很多图表的大综述，只有把生信的结果落实到生物学功能并进行实验，那生信结果才有它的价值，进一步说，只有有希望转化成临床成果的数据挖掘才是好的科研项目，当然我加了“有希望”三个字，毕竟就算是基础实验，能够转化的也不多，但是科研就是这样不是吗？毕竟不积跬步，又如何以至千里呢？
文章套路就算拆解完了，接下来我们看看文中图表是如何做出来的？我们要怎么进行复现？
Figure1分析
Figure 1 是使用Oncomine数据库对肾癌中CXC趋化因子mRNA水平进行研究，图片的解读见上一章，这期我们主要是复现，首先打开Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/resource/main.html）：
以CXCL1为例，文章采用的阈值分别为：p 0.05, fold change 2, gene rank top 10%，接下来我们在检索框中输入CXCL1，然后点击CXCL1 (Gene):
在左边的栏目设置筛选条件，分别设置：Analysis Type选择Cancer vs. Normal Analysis ，Cancer Type选择Kidney Cancer，Data Type选择mRNA，然后在右边图片上方设置筛选阈值，分别为：
设置内容及结果如下图：
上图红色框出来的Cancer VS Normal的图片就是Figure 1中CXCL1所对应的图片了，按照上述方法依次输入CXC家族其他基因，最后使用Adobe Illustrator进行拼图，拼成Figure 1的形式，这样Figure 1就完成啦。
Table1分析
看起来好像很复杂，但是我们拆开来看，表格可以用Excel进行制作，那关键就在于获取表格中的内容啦，我们需要的数据分别是：TLR基因名称，Type肿瘤类型，Fold change，P值，t-test值和Reference引用，需要注意，文章表格纳入的是肾透明细胞癌的dataset，所以表格没有CXCL1的内容，为方便大家理解和操作，我们直接使用CXCL1为例找到表格中的信息，具体操作步骤并无异同。在刚才的界面中点击右上角Other View，然后选择Dataset View：
出来的界面如下图：
表格所需要的信息除了Reference之外，其他信息都在上图红色框内，复制粘贴到Excel表格中即可，那么Reference该怎么找呢？点击图片下方作者信息：
怕大家找不到，我还标多了一个箭头，然后会弹出下方的页面：
点击红色方框内箭头所指的Pubmed即可跳转到文章的Pubmed页面，找到PMID或者DOI，接着使用Endnote进行引用即可。同样的方法查找CXC家族其他成员的信息，制作成Table 1，这样Oncomine部分的内容就此结束。
Figure2分析
Figure 2是使用UALCAN数据库对CXC家族成员进行分析，我们直接看操作部分，首先打开UALCAN网站（http://ualcan.path.uab.edu/）：
点击TCGA analysis，进入TCGA数据分析页面：
输入的Gene symbol可以一次性输入多个，避免重复操作，这里仍然以CXCL1为例，下方选择肾透明细胞癌，然后点击Explore，出来的页面如下：
然后点击Expression:
这样，Figure 2中CXCL1的内容就出来了，我们可以从图片下方框出来的p值判断这个结果是否具有统计学意义，依次操作CXC其他家族成员，下载图片后一样使用AI进行拼图，这样Figure 2就成为我们盘中餐啦！
Figure3分析
这个图展示的是CXC家族在RCC中的表达水平，文章并没有说明是哪个网站的图片，那我们不妨想一想，类似的图片，好像我们在生信全书的上篇有位老师讲过，好像就是GEPIA网站（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），那我们打开来看看:
打开GEPIA，按照上图选择“Multiple Gene Analysis ”下方的“Multiple Gene Comparison ”，进入下方页面：
在Gene List的位置输入CXC家族，然后Tissue Order选中dataset为KIRC肾透明细胞癌，其他选择默认参数，然后点击Plot，得到下方图片：
这个图片看起来和Figure 3是不是就挺像的了？下载图片后用AI再捣鼓捣鼓（其实也不用咋捣鼓），这样我们Figure 3也算搞定啦，接下来我们看看Figure 4又是什么
Figure4分析
Figure 4表示不同表达的CXC趋化因子与肾癌病理分期的关系，也就是stage分期，并且注明了是GEPIA的结果，好家伙，还好我还没关闭GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），那行， 我们还是以C XCL1 为例，来吧：
点击Expression DIY下方的Stage plot，进入下方页面后，输入基因CXCL1并选择肿瘤为KIRC，然后设置相应颜色，如下：
接着点击Plot，下方就会出来相应图片：
这个图片跟文章是一摸一样了，按照上面的步骤依次对其他CXC家族成员进行分析，然后保存所有图片后使用AI进行拼图，Figure 4又被不知不觉搞定了，好像速度有点快？接下来继续往下。
Figure5分析
Figure 5还是用GEPIA做的图，表示的是肾细胞癌患者无病生存曲线(DFS)中不同表达CXC趋化因子的预后价值，那接着我们还没关闭的GEPIA继续往下：
点击Survival下的Survival plot，进入生存分析的界面：
按照上图红色框中的内容进行设置，然后点击Plot，这样CXCL1的图就又出来了（奇怪，
我为什么要说又？）：
一样的步骤再做其他CXC家族的成员，然后进行拼图即可，接下来我们再往下：
Figure6分析
OMG，又是生存曲线，还只是把DFS换成了OS，你们别信啊，生信不是这么简单的东西，只是刚好这个文章就用GEPIA弄了好几个图而已，我们再来看看操作，还是刚才的页面，把DFS换成了OS，如下：
然后点击Plot，这样CXCL1的OS生存曲线又出来了：
这样Figure 6也完成了，诶，行吧，今天就到这里吧，我们打到了Figure 6，下回从Figure 7开始。
Figure7A分析
这个图展示的是CXC家族在RCC中的突变情况，一看就知道是cBioportal（www.cbioportal.org），我们打开网站：
在左边选择肿瘤Kidney，然后选择相应的TCGA RCC数据集，如下：
点击Query by gene，到达下面页面，然后进行相应设置：
提交后等待页面结果：
这个结果跟文章似乎稍微有点出入，可以多试试几个参数，不过这个结果是我试了几次后最接近文章结果的结果了，考虑到cBioportal曾经改版过，似乎这个有差异也算正常，既然说到cBioportal，就不得不说一下，新版的网站取消了network的模块，所以这7B和7E是没办法做了≡(▔﹏▔)≡，那我们接着继续到7C吧；
Figure7C分析
7C是STRING做的CXC家族的蛋白互作网络，STRING网站 (https://string-db.org/)，大家应该很熟了，打开网站：
点击SEARCH进入下一个页面：
按上图输入CXC家族，选择human后点击SEARCH，到达下一页面：
打开GEPIA，按照上图选择“Multiple Gene Analysis ”下方的“Multiple Gene Comparison ”，进入下方页面：
在Gene List的位置输入CXC家族，然后Tissue Order选中dataset为KIRC肾透明细胞癌，其他选择默认参数，然后点击Plot，得到下方图片：
点击CONTINUE:
这个图又跟文章的结果一致了有没有？人狠话不多，接着7D；
Figure7D分析
这个图其实我在训练营就讲过了，来过训练营的学员可能有印象，这个图是GeneMANIA (http://www.genemania.org)网站的图片，我们打开网站：
在左上角输入CXC家族成员，点击SEARCH，结果如下：
点击左下角的小圆圈可以给网络添加相应的颜色：
可以选择排名靠前的通路，也可以选择符合自己研究方向的通路，当然还可以对网络排列进行修饰：
相应的操作都在图片坐标，多点点，选择自己喜欢的style，又不花钱，点点没坏处嘛，这样我们7D也就解决了，接下来的Figure 8是 肾细胞癌中不同表达的CXC趋化因子和50个最常改变的邻近基因的富集分析，其中50个邻近基因也是从cBioportal得到的结果，也就是基于Figure 7E，网站改版后暂时无法复现，接下来看到Table 2;
Table2分析
Table 2是通过TRRUST预测CXC家族成员的转录因子，网站网址为：TRRUST (https://www.grnpedia.org/trrust/)，我们一样打开一下网页：
点击中间的SEARCH，在出来的页面拉到下方，然后如下图设置：
输入CXC家族成员之后，点击提交，得到结果如下：
将表格整理就可以放入文章中，点击表格中红框的数字，可以直接跳转到相应详情页面，这里就不给大家展开啦，最后到了Figure 9；
Figure9分析
Figure 9是不同表达的CXC趋化因子与免疫浸润细胞丰度(TIMER)的相关性，我们打开TIMER网站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)：
我们以CXCL1为例，选择TIMER首页的GENE模块，点击进入下方页面进行设置：
设置完成后点击Submit提交，得到了下方的结果：
按照上面的步骤依次分析剩下的CXC成员，然后拼成Figure 9，这样就大功告成啦！等等等等，好像还有一个表格：
Table4分析
这个表格其实也可以在TIMER进行分析，我们点击TIMER模块中的Survival，然后进行如下设置（这里我以CXCL1和CXCL2为例）：
设置完成后，在右边就可以看到相应的分析结果了：
然后整理成表格就完成啦！这样我们文章的复现操作就此结束！
这篇零代码的文章，用的很多数据库都是在我们生信全书上篇中讲解过的网站，有了好工具，关键的还是怎么组成一个好的故事，当然，思路也是很重要，当然文章复现过程中还有很多细节需要大家去进一步细化，这些都是打磨的工作，相信难不倒大家。一篇文章复现完了，也不是就此结束，我们可以思考下，还有哪些网站的哪些分析可以加进来，让数据更加丰富呢？
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