体外多生物标志物遗传毒性检测方法的建立和验证

【摘要】：目的:γ-H2AX作为目前研究较为热门的检测DNA双链断裂的生物标志物,其检测方法近年来得到广泛的发展。本课题选择γ-H2AX、p53蛋白、组蛋白H3磷酸化以及Cleaved-PARP 4个生物标志物,将其整合到γ-H2AX试验中,旨在建立一项操作简单、快速、准确的体外多终点遗传毒性检测方法。方法:本研究首先以DNA断裂剂依托泊苷、环磷酰胺( S9)和非整倍体诱导剂秋水仙素为阳性对照品,建立多终点流式细胞术遗传毒性分析方法。其次选择4种不同作用机制的断裂剂丝裂霉素C(MMC)、苯并芘(B[a]P)、甲基磺酸甲酯(MMS)、顺铂(cDDP)和2种非整倍体诱导剂长春新碱(VCR)、紫杉醇(PT)以及3种非遗传毒性化合物氯化钠(NaCL)、氨苄青霉素钠(Amp G)和普萘洛尔(Prop),以ETO、COL(24h,-S9)和CP(4h, S9)为阳性对照品,作用于TK6细胞,验证该方法检测化合物遗传毒性的灵敏度和特异性,并探讨细胞凋亡对该方法的影响。结果:在体外多终点流式细胞术遗传毒性检测方法的建立中,24h-S9处理条件下的ETO和4h S9处理条件下的CP处理TK6细胞,得到γ-H2AX和p53蛋白荧光强度相对于溶剂对照组呈现剂量依赖性增加最高超过2倍;H3组蛋白磷酸化的细胞比例与溶剂对照相比无显著升高。24h-S9处理条件下的COL诱导TK6细胞的γ-H2AX荧光强度和p53蛋白荧光强度随着浓度的升高无明显的变化;H3组蛋白的磷酸化比例随着浓度的增加而显著升高,呈现明显的浓度-效应关系。结果符合ETO和CP为断裂剂,COL为非整倍体诱导剂的报道。在体外多终点流式细胞术遗传毒性检测方法的验证中,在 /-S9处理条件下处理条件下,MMS、MMC和cDDP诱导TK6细胞的γ-H2AX和p53蛋白荧光强度随着浓度的升高而显著增加,H3磷酸化细胞比例无显著升高,试验结果提示上述三种物质为DNA断裂剂;B[a]P仅在4h S9处理条件下最高浓度诱导γ-H2AX和p53蛋白荧光强度升高超过2倍,结果为DNA断裂剂,但需后续试验进行补充验证。PT和VCR在 /-S9处理条件下,诱导TK6细胞γ-H2AX荧光强度与溶剂对照组相比无明显变化,VCR诱导p53蛋白荧光强度无显著变化而紫杉醇诱导p53蛋白荧光强度呈现浓度依赖性增加,两者诱导H3磷酸化细胞比例显著增加,呈现浓度-效应关系,提示VCR和PT为非整倍体诱导剂。NaCL、Amp G和Prop三种化合物在 /-S9处理条件下,诱导TK6细胞γ-H2AX的荧光强度和p53蛋白荧光强度与溶剂对照组相比无明显变化,H3磷酸化细胞无剂量依赖性升高。试验提示NaCL、Amp G和Prop为非遗传毒性物质。讨论:本研究建立了基于TK6细胞的体外多终点流式细胞术遗传毒性检测方法。经多种不同作用机制的化合物验证得到的灵敏度和特异性均较高。该方法具有简便、快速和高内涵的特点,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。