miCLIP-seq，即m⁶A单碱基分辨率紫外交联沉淀（m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linkingand immunoprecipitation）结合高通量测序，利用m⁶A抗体和紫外线交联，研究单碱基水平的m⁶A转录组图谱。

 现有的其他RNA m⁶A检测技术，比如meRIP和m⁶A-seq，是通过m⁶A特异抗体进行IP，然后高通量测序100nt左右的RNA片段，这些技术仅能对m⁶A位点进行一般定位，不能在特定的位点进行修饰残基的识别；此外，生物信息学上的m⁶A calling存在偏差：先验的结论基于已知的含有m6A的共有序列，这样会忽略掉存在于这些基序以外的修饰。

       miCLIP使用针对m⁶A的抗体，产生高选择性的标记：对紫外交联到抗体的RNA进行反转录，形成突变或者截断的cDNA，即表明存在结合蛋白。这项技术组合了RNA紫外交联和免疫沉淀技术，在活细胞中将蛋白质交联RNA，研究全转录组的RNA结合位点图谱，可精确识别m⁶A残基，分辨率达到单碱基水平。

技术原理

图1.miCLIP-seq技术流程

提取细胞RNA，切成片段，与anti-m⁶A抗体孵育。在254nm紫外线交联之后，抗体-RNA复合物共价结合，用protein A/G亲和提取回收，SDS-PAGE和硝化纤维膜印迹。用蛋白酶K将RNA从膜上释放，进行反转录。仍在RNA的多肽片段会导致核苷酸整合错误(表示为C→T转化)和cDNA截断。

 

技术应用

1. 绘制全转录组精确的m⁶A修饰图谱，达到单碱基分辨率级别；

2. 除了m⁶A，还可以鉴定m⁶m修饰；

3. 还能鉴定small RNA上的m⁶A修饰。

 

技术优势

1. 无需4-SU等修饰核苷酸预处理（PAR-CLIP需要）

2. 基于特征突变，准确预测m⁶A修饰

3. miCLIP对m⁶A的识别并不受峰形状影响，实现无偏鉴定

 

送样要求

样本类型：1. 活细胞样本，密度≥1×10⁷ ；

                2. 总RNA样本，质量为100-150ug。

样本物种：仅限人、大小鼠，其他物种需评估。

 

样品分组

1. 常规要求至少2组样品，包括对照组和实验组（临床样本为正常人组和患者组）。

2. 样本数建议：3 VS3。

3. 组内对照：IP组VS in put组*

注*：input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合，是必备的组分

 

测序方案

1. 测序平台：IlluminaHiSeq X10/Hiseq 4000

2. 测序模式：SE 50

3. 测序数据量： 40M

 

案例： Linder B. NatMethods. 2015. 单碱基分辨率的m⁶A和m⁶Am全转录组图谱

 

图2. miCLIP-seq结果

miCLIP在单碱基分辨率识别ncRNA MALAT1上的m⁶A残基。3个SCARLET阴性位点聚集在110nt长的序列中，CIMS和CITS miCLIP-seq在准确识别两个SCARLER阳性位点的同时，并没有识别到中间的SCARLET阴性位点，显示出优秀的空间分辨率和低错误率。CIMS：交联诱导的突变位点；CITS：交联诱导的截断位点。

案例原文: Linder B, GrozhikAV, Olarerin-George AO, et al.Single-nucleotide resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 2015 Aug;12(8):767-72.