免疫荧光技术是以抗原抗体反应为基础，结合荧光标记示踪，对细胞或组织内的特定物质进行定性或定位的一种检测技术，兼具高特异性和高灵敏度的优点。免疫荧光技术既可以应用于细胞，也可以应用于组织样本。基于抗原抗体反应具有的高度特异性，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，荧光素标记抗体与组织细胞抗原反应，洗涤分离后用荧光显微镜观察呈特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。
用于免疫荧光标记的荧光物质要求能够与抗体稳定结合，易于保存，标记抗体的同时既不影响抗体原有的高特异性、高亲和力，荧光物质自身也保持较高的荧光效率。免疫荧光常用染料有异硫氰酸荧光素FITC、藻红蛋白类PE、罗丹明等。根据荧光素标记的抗体的不同可分为直接法和间接法。直接法是将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用荧光标记的抗抗体（第二抗体）与一抗反应，使之形成抗原-抗体-二抗复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。相较于间接法，直接法特异性好，操作简便，速度更快。[1]区别于免疫组化酶底物染色方法，荧光示踪不需要显色反应的步骤直接在特定波长发光，在特异性及灵敏度上更优，同时有需要的话也更方便进行多重染色。冰冻切片用于免疫荧光，操作快速步骤简单，抗原表位处于较天然的状态，能够较好地保存组织的抗原免疫活性。[2]
免疫荧光技术广泛应用于肾小球疾病和某些皮肤疾病的诊断中。肾组织冰冻切片的免疫荧光染色法特异性强、敏感度高，对荧光标记物的分布部位、分布型式和荧光强度显示极为明确，因此为国际上公认的较好观察方法。[3]某些皮肤疾病的免疫球蛋白的沉积模式具有特征性，免疫荧光检测在大疱性皮损、系统性红斑狼疮和血管炎中尤其有用。
免疫荧光法是评估肾脏活检的金标准。它是一种一步式技术，方法相对简单，灵敏度高，特异性强,并且是大多数组织病理学家的首选。该方法利用荧光素标记的抗体检测肾脏冰冻切片上的免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、kappa、lambda、C3、C1q和纤维蛋白，用于肾脏疾病的诊断。[4]我国肾病专业医疗控制指标指出IgA肾病病理切片染色至少包括光镜染色（HE、PAS、Masson、PASM）和免疫荧光染色（IgG、IgA、IgM、C3、C4或 C1q、Fib）。[5]肾小球肾炎的发病机制为Ⅲ型变态反应。引起变态反应的抗原在体内诱导机体产生抗体，即免疫球蛋白，主要为IgG、IgA和IgM。免疫球蛋白与抗原形成循环免疫复合物沉积于肾小球或直接在肾小球形成原位免疫复合物，导致肾小球肾炎的发生。可以与免疫球蛋白IgA的α链反应，用于肾小球肾炎的免疫复合物种类检测，有助于对肾小球肾炎的功能性分类。人体内免疫复合物可通过经典途径和旁路途径激活补体从而引起变态反应造成肾小球组织的损伤。在肾小球疾病中，补体多数通过旁路途径激活，少数经经典途径激活。肾活检中常用的补体抗体为C3、C4、C1q及备解素。
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部分肾脏疾病的免疫荧光染色模式
自1960年免疫荧光技术便被引入皮肤病学用于病理生理学研究及皮肤病诊断，特别是自身免疫性大疱病和结缔组织病。应用中主要分为三种类型，直接 IF (DIF)，用于检测固定在组织中的抗体和补体成分；间接 IF (IIF)，用于检测患者体内的循环抗体；血清和补体固定 IIF (K-IIF)，后者在检测补体结合循环抗体时更为敏感。自身免疫性大疱性疾病 (ABD) 可根据水疱形成部位分为两组：表皮内 ABD 和表皮下 ABD。采用DIF技术检测两组ABD中的抗粘附分子抗体诊断准确率接近100%。IIF 检测和测量的循环抗体滴度与天疱疮的活动相关，但与类天疱疮无关。还有两种常规使用的改良 IIF 技术，裂皮 DIF 和 IIF，两者最常用于区分表皮下 ABD，因为它们具有许多临床、组织病理学和免疫病理学特征。DIF 测试最有助于诊断结缔组织病 (CTD)，尤其是红斑狼疮。由于存在假阳性和阴性结果，DIF 结果应与临床组织学和血清学特征相关联。白细胞破碎性血管炎和过敏性紫癜的不同免疫反应物也可用DIF检测。对于扁平苔藓、多形性红斑，在大多数患有这些疾病的患者中都可以发现 DIF 测试中荧光的特征模式。[6]
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部分皮肤病的免疫荧光染色模式
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通灵生物免疫荧光抗体
【检验方法】
肾组织3μm冰冻连续切片，稍微风干。
95%冷丙酮固定20分钟。
PBS清洗2分钟×3次。
滴加本产品抗体试剂，置于湿盒内37℃孵育30分钟。
PBS清洗2分钟×3次。
水溶性封片剂封片。
在荧光显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。
【阳性判断值】
荧光显示的强度：采用FITC标记，肾组织特异性荧光染色呈翠绿色。
可分为:
-（高倍镜下均不显示），
±（低倍镜下不显示，高倍镜下隐约可见荧光）
+（低倍镜下隐约可见，高倍镜下可见荧光）
++（低倍镜下可见，高倍镜下清晰）
+++（低倍镜下清晰，高倍镜下耀眼）
++++（低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼荧光）
● 参考文献
1. Kyuseok I., et al.,An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods Mol Biol. 2019;1897:299-311.
2. Alwahaibi, N.Y., et al., Immunoperoxidase and Immunofluorescence on Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Sections versus Immunofluorescence on Frozen Sections in the Assessment of Renal Biopsies. Indian J Nephrol, 2020. 30(1): p. 8-13.
3. 陈威等. 肾脏病理免疫荧光的鉴别诊断[C]. 中华医学会肾脏病学分会2004年年会暨第二届全国中青年肾脏病学术会议专题讲座汇编. 2004: 杭州. p. 117-119.
4. Wągrowska-Danilewicz, M. and J. Zeromski, Immunofluorescent evaluation of renal biopsy: current point of view. Pol J Pathol, 2010. 61(2): p. 83-8.
5. 肾病专业__医疗质量控制指标（2020 年版）.
6. Medenica, L. and D. Skiljević, Diagnostic significance of immunofluorescent tests in dermatology. Med Pregl, 2009. 62(11-12): p. 539-46.
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