干货 | PCR技术基本原理

PCR技术的基本原理

PCR技术定义

聚合酶链反应技术（Polymerase chain raction ,PCR）是一种在体外扩增特定DNA片段的方法，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，可用很短时间使目的基因或某一片段扩增十万乃至几百万倍。

PCR基本成分

1

模板DNA

来源比较广，几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。

2

缓冲液

用于维持DNA聚合酶的活性和稳定性。

3

dNTP

四种dNTP是PCR原料，其比例和浓度与PCR密切相关。

4

TaqDNA聚合酶简称Taq酶

在1969年在美国黄石国家公园温泉中发现。Taq酶具有良好的热稳定性，在92.5℃、95℃和97.5℃的半衰期为120 min、40 min、5min；

5

其它成分

Mg^{2 能活化DNA聚合酶；二甲基亚砜有利于DNA的变性；TMAC可去除非特异扩增，促进PCR；甘油有利于DNA复性，不过并不是对所有的PCR都有利；}

PCR反应基本步骤

• 变性：根据DNA高温变性的原理，将反应体系温度升至变性温度（高于模板熔点，约95℃），使目的DNA双链裂解成PCR模板（单链）。[95℃，30s]

• 退火：将反应体系温度骤降至退火温度（低于引物熔点约55℃），是PCR引物与PCR模板3’端杂交，称为退火。[55~65℃，30s]

• 延伸：将反应体系温度升至延伸温度（约72℃），DNA聚合酶按照碱基配对原则在引物3’端以5’→3’方向催化合成PCR模板新的互补链，使目的DNA拷贝数增加1倍。[72℃，30~60s]

常见PCR

• 常规PCR：

直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。

• 热启动PCR：
  

热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。该方法主要利用抗体、亲合配体、适体或化学修饰物等酶修饰酶，来抑制室温下的DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR体系配制阶段引物与模板、引物与引物之前的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。

• 巢式PCR：

巢式PCR是标准PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。

• 快速PCR：

在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需时间来完成更快的扩增，且不会影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于具有高扩增能力的DNA聚合酶，这类聚合酶在每个结合中可引入更多的核苷酸。

• 高GC含量PCR：

具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。

• 多重 PCR:

多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多种PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品，还能够同时对比多个扩增子

• 长片段 PCR:

长片段PCR通常是指扩增大于5kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用 Taq DNA 聚合酶（用于快速延伸）和高保真酶（用于提高准确性）的混合物。

• 定量PCR:

序列的扩增程度（得率）取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其中，最常见的应用是 基因表达定量。

PCR技术创始人-卡里.穆利斯

2019年8月7日，诺贝尔奖得主卡里·穆利斯（Kary Mullis）因为肺炎去世，享年74岁。

1993年，他因开发了聚合酶链式反应法（PCR）获诺贝尔化学奖。这一发现不仅使警方能够更好地利用DNA证据来对付罪犯，还激发了电影《侏罗纪公园》中利用化石DNA克隆恐龙的灵感。

如今PCR已成为生物化学和分子生物学的一项核心技术，《纽约时报》如此评价：“具有高度原创性和重大意义，几乎将生物学分为PCR前和PCR后两个时代。”

穆利斯发明的PCR技术有着极其广泛的应用。在医学诊断中，该技术使直接从很小的遗传物质样本中识别细菌或病毒感染的病原体成为可能；它还被用于筛查镰状细胞性贫血和亨廷顿舞蹈症等遗传病患者；进化生物学家可利用该技术研究从远古物种化石残骸中提取出微量DNA，法医学家则利用PCR技术从犯罪现场遗留的血迹、精液或发丝中识别犯罪嫌疑人或受害者。

如今这项技术变得更加廉价，更加自动化。这彻底改变了生物化学、分子生物学、遗传学、医学和法医学等各个领域，并最终使人类基因组图谱得以绘制出来

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