1.RT-PCR，qPCR，Real-time PCR，RT-qPCR区分
RT-PCR指的是逆转录PCR（Reverse Transcription PCR），在RT-PCR中，RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板通过PCR进行DNA扩增；qPCR和Real-timePCR均指实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-Time PCR），相较于常规PCR，qPCR能够在每个循环周期内对扩增产物进行实时定量，从而对起始模板数量进行精确的分析，具有高敏感度和特异性；RT-qPCR指的是实时逆转录PCR（Reverse Transcription- quantitative PCR），是qPCR RT-PCR的组合，将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行qPCR定量分析。
2. SYBRGreen I染料法
SYBR Green I染料：一种可以在PCR循环过程中随着PCR产物的累计而对其进行检测的高度特异性双链DNA结合染料；原理：通过SYBR Green I染料与PCR过程中产生的双链DNA结合，而对PCR产物进行实时检测；过程：（1）在PCR过程中，DNA聚合酶可对目标序列进行扩增，产生PCR产物，即“扩增子”；（2）SYBRGreen I染料与每一个新产生的双链DNA分子进行结合；（3）随着PCR的进扩增，越来越多的扩增子生成，由于SYBR Green I染料可与所有的双链DNA结合，因此荧光强度也会随着PCR产物的增加而增加；（如下图所示）优点：对DNA模板没有选择性，可用于监测任何双链DNA序列的扩增，运行成本低；缺点：SYBR Green I染料可能与非特异性的双链DNA序列发生结合，产生假阳性信号。除此之外，需要不断的优化反应体系以降低非特异性扩增。
图片源自：https://www.smobio.com/faq-real-time-pcr
3. Taqman探针法
原理：通过荧光探针在PCR循环过程中随PCR产物的累积而对其进行检测。
过程：（如上图所示）
(1) 构建Oligo探针：5’端标记荧光染料报告基团（Reporter, R），3’端标记淬灭基团(Quencher, Q)。当探针保持完整时，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能量转移（FRET）而显著降低报告基团发射的荧光；
(2) 如果存在目标序列，探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火，并随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除；
(3) 探针的切除将报告染料基团和淬灭染料基团进行分离，增强了报告染料基团的信号。并且可以将探针从目的链上去除，使引物继续沿模板链末端延伸；
(4) 每经过一个循环，就会有更多的报告基因染料分子从各自的探针上切断，荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加；
优点：（相较于SYBR Green I染料法）
(1) 高特异性和灵敏性：荧光探针只与目的序列结合，不受非特异性产物的影响；
(2) 兼容多重反应：由于不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，因此可以选择不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内同时扩增并检测不同的序列；
(3) 节省时间和原料成本：无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本；
缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针。
4. 绝对定量（Absolute Quantification）
原理：根据标准曲线对未知样品进行的定量。
举例：可以通过qPCR计算出待测样本的初始拷贝数，如1ml血液里有多少个HBV病毒。可根据病毒的拷贝数，监控疾病状态。
5. 相对定量（Relative Quantification）
原理：用于分析特定样品相对于参照样品某个基因表达量的变化。
举例：用于检测药物引起的基因表达改变，将经药物处理样品的特定目标基因的表达水平相对未处理样品的基因表达水平进行比较。
结果分析相关术语
6. 扩增子（Amplicon）PCR过程扩增产生的DNA短片段。7. 扩增曲线（Amplification Plot）PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光信号为纵坐标制作的曲线。（如下图所示）扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。8. 基线（Baseline）PCR起始时，荧光信号还未发生变化的几个循环。9. 本底信号即样本的荧光背景值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，可通过算法去除。10.荧光阈值（Threshold）荧光域值设定在PCR扩增的指数期，缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，通常仪器会自动设置。如果手动设置，原则要大于样本的荧光背景值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段。11.循环阈值（CycleThreshold, Ct值）Ct值是指在荧光 PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值与模板的拷贝数存在线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct 值也就越小。12.惰性参比染料（ROX）用作荧光信号标准化内部参照，可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。通常，不同仪器有不同ROX需求，目前国产仪器基本无需ROX校准要求。13.均一化报告基团（Rn）荧光染料报告基团（Reporter, R）释放的荧光强度除以惰性参比染料的荧光强度。14. ΔRn在特定PCR条件设置下所产生的信号量级。ΔRn=(Rn )– (Rn-)，Rn : 一次反应的Rn值，Rn-：未反应样品的Rn值。
15.熔解曲线（Meltingcurve）qPCR扩增完成后，对PCR产物加热，随温度升高，DNA逐渐解链，导致荧光强度下降，当到达某一温度时（Tm），会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，对PCR的特异性进行鉴定。（如下左图所示）16.熔解温度（Tm）DNA双链解链一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。17.对数曲线（logarithmcurve）对熔解曲线取对数，形成峰图，更直观的显示PCR产物片段的情况。通常根据引物设计原则，扩增产物长度在80-300 bp范围内，熔解温度在80℃-90℃之间。（如下右图）
绝对定量相关术语
18.标准品（Standards）用于构建标准曲线的已知浓度样品，为保证标准品的稳定，通常将基因片段克隆到质粒后，作为标准品。19.标准曲线（StandardCurve）将已知浓度的标准品进行梯度稀释（通常为5-6个稀释梯度），将未知样品和梯度稀释的标准品在同一qPCR实验中进行反应。根据扩增曲线，以稀释标准品的Ct值为横坐标，起始拷贝数的log值为纵坐标构建。（如下图所示）理论上，稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距（两个样本Ct值差）符合等式“2n＝稀释倍数”，如：10倍稀释的样本，2n＝10，n=3.32，即Ct值差为3.32。20.扩增效率（Amplificationefficiency）扩增效率与标准曲线的斜率相关，斜率的绝对值与荧光曲线间距相同，扩增效率计算式为E＝10-1/斜率，如果将扩增效率用百分率来表示，则E%=(E-1)×100%。一般说来，扩增效率接近 100%是重复性好的标志，然而在实际操作时，扩增效率应该在90%-105%之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；若扩增效率大于100%，可能由于稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。
相对定量相关术语
21.内参（Internalreference）在同一反应中作为靶序列扩增，并用不同的探针进行双重PCR检测的对照序列。22.内参基因（Referencegene）内源性参比基因的表达水平在样品间不存在差异，如管家基因（Housekeepinggenes, HKGs），常用GAPDH、β-actin 、18SrRNA和28S rRNA等。23.标准样品（StandardSample）相对定量中使用的参比样品，用与其他样品进行比较，确定某一基因的相对表达水平。24.阳性对照（PositiveControl）用已知量模板作对照，通常用来检查引物工作是否正常，以及反应程序是否正确设置。25.阴性对照（NegativeControl）重要的阴性对照包括无模板对照（No template control，NTC）和无反转录酶对照（No reverse transcriptasecontrol，NRC）。NTC：包含除模板之外的所有扩增反应所必要组分的对照反应，模板通常用水代替，用于检测试剂污染或外源DNA造成的污染；NRC：在反转录的时候多配制一个体系，不加反转录酶，其余成分正常添加，在相同的反转录过程下获得的产物，以此为模板，观察扩增情况，用于检验cDNA中是否有基因组DNA的污染。
百力格探针引物合成
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qPCR探针类型
类型
详情
单标荧光探针FAM、VIC、HEX、TET、ROX、JOE、Cy3、CY5、TAMRA、Texas Red等
双标荧光探针
荧光基团：FAM、VIC、HEX、ROX、Cy3、Cy5、NED等
淬灭基团：MGB、BHQ、TAMARA系列等
特殊单标荧光探针地高辛Dig、磷酸Phosphorylation、生物素Biotin等
修饰硫代修饰、氨基修饰、巯基修饰、稀有碱基等
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参考文献：
[1]https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/essentials-real-time-pcr.html；
[2] https://zhuanlan.zhihu.com/p/388534929
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[4] Zachar V, Thomas RA,Goustin AS. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR forefficient analysis of multiple samples. Nucleic Acids Res.1993;21(8):2017‐2018.
[5] Livak KJ, SchmittgenTD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCRand the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402‐408.
[6] https://www.smobio.com/faq-real-time-pcr
[7] https://www.sohu.com/a/402527474_120676324
