手动层析柱装柱流程

层析柱的装柱是生物制药下游纯化领域的必备技能，但是是否能装出一根高柱效的层析柱，不仅要求操作者眼明手快，还需胆大心细。在此，小编带领大家一同回顾手动层析柱的装柱流程，看看你在装柱过程中是否漏掉了什么，为下次装出更高柱效的层析柱做好准备！

装柱方案确定

1. 确定填料：先确认准备装填的填料，并根据填料粒径确定层析柱筛网。确定装柱流速和压力。确定填料的压缩因子、筛网选择一般可参考如下标准：

层析柱筛网选择推荐

2. 确定装柱规模：确定目标装柱体积，并计算所需层析柱的高度和内径。

3. 确定装柱缓冲液。

4. 准备对应的装柱泵或者层析系统。

装柱流程

1

清洗层析柱排气泡

将层析柱柱管和筛网清洗干净（提示： 筛网应定期用0.5M NaOH超声清洗，用20%乙醇排除气泡），并将柱子调节水平。

排柱底及下筛网气泡时，先将层析柱底端接一个四路两通阀，然后用一根管接到一个泵或者层析系统上。然后通过泵或者层析系统从柱底泵入装柱缓冲液，至管子内部没有气泡后，用注射器伸进层析柱里把下筛网表面的气泡吸出来。用同样的方法排柱头及上筛网的气泡。排完气泡后，层析柱里留 1-2 cm 高度的缓冲液。

2

准备填料匀浆

1.    用装柱缓冲液将原本填料中的缓冲液置换干净，同时调节填料浓度约为 50%-75%。

2.    所需匀浆体积(ml)=(装柱体积(ml)*压缩因子)/ 匀浆浓度

3

去碎胶

1.介质搅匀--2.静置--3.去除上清液--4.加缓冲液再次搅匀、静置、去上清液--重复2-3次。

填料粒径与静置时间：

填料粒径

静置时间

100μm

15-30 分钟

65μm

30-45 分钟

45μm

45-60 分钟

35μm

60-90分钟

装柱前务必进行小颗粒去除的操作!

小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的反压增大。

4

倒胶

关闭柱底四路两通阀，在搅胶棒的引流下，把搅拌均匀的填料匀浆快速、温和地倒入层析柱中，可用少量缓冲液润洗填料容器确保残余填料都倒入层析柱。然后用搅胶棒再次把层析柱内的匀浆顺时针或垂直搅拌均匀，取出搅胶棒，静置。让填料在层析柱内静置片刻至上层出现分层。

在此过程中应注意避免产生新的气泡。

5

压胶

填料在层析柱内静置片刻至上层出现分层（不分层也可以继续下面的步骤）。封闭出口，松开入口管线，稍微放松柱头上的密封圈，缓慢把柱头放置于液面上端1-2cm处，泵入缓冲液排空柱前空气，拧紧密封圈。

拧紧入口管线，打开出口，使用层析系统或装柱泵泵入缓冲液冲洗和压实柱床。

在此过程中主要有三种方法，分别是恒流法，恒压法，恒流加恒压法。

对于恒流或恒压法，一般需要根据对应填料及柱高的压力流速曲线（见下图），来选择合适的恒定流速或者恒定压力来进行装柱。我们一般取最大流速的 70% 为最优装柱流速。待柱床稳定后，记录胶面高度，此时胶面高度除以压缩因子即为胶面理论高度。关闭出口，打开入口管线，将柱头匀速下降至理论高度，完成装柱。

压力-流速曲线

对于一些较难装的填料，如GE Sepharose HP, Superdex pg 等，需要先恒流再恒压的方法。即排气完成后，以恒定流速压胶 2 小时，然后在固定压力压胶 45 分钟后，记下此时柱床的高度。再将柱头压到此高度下3mm位置，装柱即完成。

6

测柱效

按照上述方法装好后， 测柱效，合格后即可使用了。

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