【作者】黄林环 张易 林少宾 吴坚柱 方群 王子莲
【单位】中山大学附属第一医院妇产科
【摘要】目的 探讨单合子之单绒毛膜双羊膜囊（monochorionic diamniotic,MCDA）双胎之一胎先天性心脏病（简称“先心病”）产前诊断。方法 2013年1月至2017年6月在中山大学附属第一医院妇产科就诊的MCDA双胎之一胎先心病共79对，每对胎儿分别行羊膜腔穿刺，羊水标本送检染色体核型分析和染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis,CMA），并对其产前诊断的结果进行临床分析。结果 79对中75对共150个胎儿进行了CMA，71对共142个胎儿进行染色体核型分析。染色体核型异常检出率为7.7%（11/142）；除外良性拷贝数变异（copy number variant, CNV），CMA对CNV和非整倍体的检出率为21.3%（32/150），高于核型分析（c2=8.025，P =0.005）；核型正常胎儿异常CNV检出率为16.0%（21/131）。5对单合子双胎两个胎儿间存在不一致的染色体核型或CNV，发生率为7.0%（5/71），其中4对先心病胎儿检出异常核型或CNV，而心脏发育正常胎未检出异常。结论 对于先心病的产前诊断，CMA较传统的核型分析具有更高的检出率。单绒双胎尤其单合子双胎可存在遗传异质性，当MCDA双胎出现先心病，尤其两胎表型不一致时，有必要对双胎同时进行侵入性产前诊断。
先天性心脏病(简称“先心病”)，是胚胎及胎儿时期心脏及其血管发育异常或在胚胎早期停止发育所致的出生缺陷疾病，发病率在活产儿中为8‰～10‰，是人类出生缺陷发病率最高的疾病。
已有回顾性临床研究数据显示，先心病在双胎中的发病率较单胎更高（1.7%~7.5% vs 1.8%~2%），为单胎妊娠的3～7倍，其中单合子双胎先心病的发生率远高于双合子双胎，单合子之单绒毛膜双羊膜囊（monochorionic-diamniotic, MCDA）双胎常会发生两胎发育不一致，导致围产结局显著不同。
本研究拟通过对一胎发生先心病的MCDA双胎产前诊断结果进行分析，探讨MCDA双胎之一胎儿发生先心病的产前临床咨询和管理策略，并进一步为先心病的病因学研究提供依据。
资料与方法
一、研究对象
收集2013年1月至2017年6月就诊于中山大学附属第一医院妇产科的双胎妊娠孕妇的临床资料。纳入标准为MCDA双胎，一胎超声检出心血管异常，另一胎心脏发育正常。
二、研究方法
1. 资料收集：
采用回顾性研究分析方法，通过医院病历系统数据库收集患者的临床资料。
2. 产前超声检查：
采用GE Voluson E8超声仪对胎儿进行检查，高分辨超声波扫查胎儿心脏标准切面，包括四腔心切面、动脉流出道和大血管切面；胎儿超声心动图扫查切面包括心尖四腔切面、大动脉长轴切面、大动脉短轴切面、三血管切面、上（下）腔静脉切面、主动脉（动脉导管）弓切面等。
3. 双绒毛膜性的鉴定：
早孕期超声检查显示双胎间“T”征并在中晚期超声提示双胎性别相同，可初步判定为单绒毛膜双胎；分娩后检查胎盘分隔处为两层羊膜，则为MCDA双胎。
4. 胎儿标本的采集：
孕妇在知情同意情况下进行超声介导下羊膜腔穿刺术，获得胎儿羊水标本。原则上对MCDA双胎的两个胎儿均同时进行羊膜腔穿刺。
5. 染色体核型分析：
胎儿羊水标本按常规进行细胞培养，收获细胞后常规检查及G显带核型分析，显微镜下计数30个分裂相，分析5个，如果遇到嵌合体加大计数量。
6. 染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis, CMA）：
采用美国Affymetrix公司的CytoScan HD芯片平台（Genome-Wide Human SNP Array）进行染色体微阵列分析，其包含1 950 000个可用于检测全基因组范围内拷贝数变异（copy number variant, CNV）的探针，利用芯片平台对样本基因组DNA进行CNV扫描后配合GeneChip CNAT分析软件进行分析。根据美国医学遗传学指引，比对数据库，包括国际公共良性 CNVs数据库(database of genomic variants，DGVs)、UCSC genome browser、国际公共病理性 CNVs 数据库(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensembl resources, DECIPHER)、人类孟德尔遗传数据库 (online mendelian inheritance in man, OMIM)和人类遗传学细胞遗传学微阵列委员会在线数据库(international standard cytogenomic array consortium, ISCA)等，将CNV可分为四类：致病性CNV、可能致病性CNV、意义未明的CNV（variation of unknown significance, VUS）以及良性CNV。本研究采用GRCH37(hg19)对基因组进行注释，参考网站http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19。
三、统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件包进行数据分析。计数资料采用频数和率表示，组间差异采用 c2检验，P<0.05有差异有统计学意义。
结 果
收集双胎之一胎先心病的MCDA双胎共79例，妊娠16~32周，获取150份胎儿羊水标本。获随访75例，失访4例，随访率94.9%。引产17例，2例28周前流产，56例分娩。13例进行了选择性减胎，其中射频消融减胎12例均获得活胎分娩，随访心脏彩色多谱勒超声以及生长发育均无异常，脐带电凝减胎1例于孕27周流产。
79对MCDA双胎共150个胎儿进行染色体微阵列分析，其中每对胎儿均行CMA的有71对（共142个胎儿），另8对胎儿因一胎羊水过少无法获得胎儿标本，仅一胎行CMA。71对MCDA双胎同时接受了染色体核型分析和CMA，并通过单核苷酸多态性的微阵列（single nucleotide polymorphism arrays, SNP array）鉴定为单合子双胎。研究流程如图1所示。
一、 MCDA双胎之一胎先心病的分布
79对MCDA双胎之一胎先心病中无心畸形最常见，占25.3% (20/79)，其他先心病依次为室间隔缺损或房室间隔缺损(22.8%，18/79)、肺动脉狭窄/闭锁(13.9%，11/79)和法洛四联症(8.9%，7/79) （表1）。此外，有17.7%(28/158) 的MCDA胎儿出现心脏以外器官异常，仅2对MCDA双胎同时出现心脏以外器官异常，包括鼻骨缺失、颈项透明层（nuchal translucency, NT）增厚、右锁骨下动脉迷走。
二、MCDA双胎产前诊断染色体结果
71对MCDA双胎共142个胎儿进行了染色体核型分析，11个胎儿检出异常，检出率7.7%（11/142），包括21-三体综合征6例，47,XYY 2例，47,XXX、47,XXX/46,XX、45,X 各1例（图1）。
三、MCDA双胎产前诊断CMA结果
150个胎儿进行了CMA，41个胎儿检出35个CNV和11个染色体重排，前者包括5个致病性CNV，6个可能致病性CNV，14个VUS和10个良性CNV。除外良性CNV，32个胎儿中检出36个CNV和非整倍体，因此，不包括良性CNV，CMA对CNV和非整倍体的检出率为21.3％（32/150），高于染色体核型分析的7.7%（11/142）（ c2=8.025，P=0.005）（图1）。在3对无心双胎中，5个胎儿检出2个致病性CNV，2个可能致病性CNV和1个 VUS。（见表2病例9，10，23）。
四、染色体核型分析与CMA
1. 染色体核型分析与CMA同时检出异常
71对双胎同时行染色体检查及CMA，6对MCDA双胎中的11个胎儿的核型分析和CMA同时检出非整倍体（7.7％，11 /142），其中5对双胎均受累，只有一对双胎中是一个胎儿受累。
2. 染色体核型分析核型正常而CMA检出异常
对染色体核型正常的131个胎儿进行CMA检查，一共12对胎儿中检出21个胎儿（16.0%, 21/131）存在异常CNV。其中3对胎儿出现不一致的CNV，即一胎检出异常CNV而另一胎CMA正常（病例6，17，23）（表2）；另9对双胎均检出异常CNV。12对双胎共检出25个异常CNV，其中致病性CNV 5个，可疑致病性CNV 6个，意义不明CNV 14个。致病性CNV包括22q11微重复综合征2例，Smith-Magenis综合征2例，1例为4q34.3q35.2的嵌合缺失。见表2。
五、双胎染色体核型或CNV不一致
尽管71对MCDA双胎都是单合子双胎，但有5对双胎2个胎儿间存在不一致的染色体核型或CNV（表3），发生率为7.0%（5/71）。病例4显示正常表型的胎儿核型为47,XXX/46,XX的嵌合体，而伴有肺动脉狭窄的另一胎为47,XXX。病例16，左心发育不良胎儿是X单体，但具有正常表型的另一胎儿核型正常。病例6，法洛四联症胎儿出现4q34.3q35.2的嵌合性缺失，而在MCDA另一胎中没有检测到CNV。病例17和23中，心脏异常胎儿分别检出意义未明的3p24.2和4q22.3 微重复，而另一胎均未检出异常CNV。见表3。
讨 论
一、 MCDA双胎之一胎先心病及其遗传病因
胎儿先心病的诊断主要依靠产前胎儿超声或超声心动图检查。对于单胎妊娠，Marek等报道的1604例病例中，常见的先天性心脏病类型为房室间隔缺损(15.1%)、左心发育不良(15.0%)、室间隔缺损(9.1%)、右室双出口(8.7%)、肺动脉闭锁(6.0%)和法洛四联症 (5.2%)；与产前不同，出生后诊断的先心病中以室间隔缺损最为多见，占41.6%，其他依次为左心发育不良（3.9%）、房室间隔缺损（3.9%）和右室双出口（1.1%）。
而双胎妊娠较单胎发生先天畸形的发生率更高，其中心脏畸形最为常见。据报道，单绒毛膜双胎心脏畸形的发生较单胎升高172%，多为复杂性畸形，并且预后不良。对于双胎妊娠，尤其单绒双胎之一胎先心病，本研究数据显示，无心畸形最多，占25.3%；其次为室间隔缺损或房室间隔缺损，占22.8%，其他依次为肺动脉狭窄或闭锁(13.9%)和法洛四联症(8.9%)，先心病的分布与单胎类似。
从遗传的角度可将先心病的病因分成染色体异常、单基因病和多基因病。染色体异常所导致的先心病占8%~13%，是先心病最常见的遗传病因。在本研究中，21-三体综合征是引起双胎之一先心病最常见的染色体异常，占54.5%（6/11），其余均为性染色体的非整倍体。致病性CNV与先心病发病的关系已经得到了证实，其中最典型的是22q11.2微缺失综合征。本研究结果显示，除外良性CNV，CMA对CNV和非整倍体的检出率21.3％，高于染色体核型分析的7.7%（P<0.05）。
此外，本研究对染色体核型正常的131例胎儿进行CMA检查，21例（16.0%, 21/131）检出25个异常CNV，其中致病性CNV 5个（包括22q11微重复综合征，Smith-Magenis综合征和4q34.3q35.2的嵌合缺失），可疑致病性CNV 6个，意义不明CNV 14个。由此可见，CMA作为细胞遗传学检测手段中最新的一种，有相对以往经典的遗传学检测无法比拟的优势，由于其高分辨率和灵敏度，它能检出传统的核型分析技术未能检出的染色体微缺失或微重复，将染色体病的诊断提高到亚显微水平，提高了先心病的阳性检出率，尤其避免了一些微缺失微重复综合征由于在胎儿期表现隐匿而造成的漏诊。然而，一些意义不明CNV的检出，给临床咨询带来了极大的挑战。
双胎之一无心畸形又称双胎反向动脉灌注序列征（twin reversed arterial perfusion sequence, TRAP）是MCDA双胎特有的并发症，目前认为是血流的反向灌注导致了胚胎发育异常，同时抑制正常心脏的发育，而遗传病因方面仅有少数染色体异常的报道。本研究中3对无心畸形双胎有5个胎儿通过CMA分别检出2种致病性CNV，2种可能致病性和1个意义不明的CNV，染色体畸变的异常率高达83.3%（5/6），提示虽然目前广泛认为TRAP的发生与“血管反向灌注理论”的假说相关，但应注意胎儿出现染色体畸变的可能，尤其在进行下一步治疗（如射频消融减灭无心畸胎）前，应注意被保留胎儿存在发育异常的风险，建议常规进行双胎产前诊断，排除染色体以及CMA的异常。
二、MCDA双胎染色体核型及CNV的不一致
既往认为单合子双胎具有相同的基因型和表型，但近来关于单合子双胎遗传异质性的报道越来越多，已有MCDA双胎之一为21/18/13-三体综合征、21单体、X单体以及性别不一致等核型不一致的报道，但尚无MCDA双胎核型不一致的发病率的报道。本研究数据中，两胎间染色体核型或CNV不一致的发生率为7.0%，其中2对双胎为核型不一致，一对双胎为45,X和46,XX，而另一对双胎一胎为47,XXX/46,XX嵌合，另一胎为47,XXX。究其原因，除外少数来源于双合子的MCDA双胎，单合子MCDA双胎核型不一致的可能机制有后期延滞、染色体不分离、三体自救等。合子后胚胎发育早期有丝分裂时，部分正常囊胚细胞发生后期延滞，1条性染色体X或Y滞留在细胞质中而丢失，形成45,X细胞，同一卵裂球同时存在的45,X和正常核型2种细胞系通过细胞识别机制互相辨认，相同的细胞聚集，不同的细胞相排斥，重新形成不同的细胞团，最终分化成45,X和46,XX核型不一致的2个胚胎。而三体的发生可能是有丝分裂过程中染色体不分离，形成双胎后，其中一胎的部分细胞是通过三体自救成为正常核型，从而出现47,XXX/46,XX嵌合。此外，亦不排除为47,XXX和46,XX双胎，由于MCDA双胎间的血管吻合，不同核型的双胎间通过血液交换而出现嵌合体。
关于双胎间的先心病表型的不一致，虽然已提出多种理论，但确切的病理机制尚不清楚，一个可能的解释是内细胞团的不均等分，从而导致了一部分发育不一致的心血管异常。此外，脐带插入异常和单绒胎盘可能是与双胎心血管异常有关的宫内环境因素。越来越多的证据表明，即使两个胎儿有相似的遗传背景，胚胎发生过程中发生的表观遗传效应可能是导致单合子单绒毛膜双胎表型不一致的重要原因。Breckpot等通过对6对具有不一致先心病表型的MCDA双胎进行CNV分析，其中一对双胎出现了CNV的不一致，考虑CNV的差异发生在合子后的，提示合子后事件、表观遗传等机制的参与。然而Zhang等通过对9对（其中包括5对先心病）表型不一致的单合子双胎进行全外显子测序，结果发现体细胞编码区域内的突变并未对单合子表型不一致的表达起重要作用。本研究共检出3对双胎发生CNV不一致（其中1例为致病性的4q34.3q35.2的嵌合性缺失，而另两例均为意义未明的微重复），发生率为4.2%（3/71），较Breckpot等报道的1/6低。因此，CNV的差异是否为先心病表型不一致的原因，单合子为何出现CNV的不一致，是否与合子后的表观遗传修饰有关，尚需进一步研究。
双胎先心病的产前诊断CMA较传统的核型分析具有更高的检出率。单合子之MCDA双胎一胎先心病，两胎间染色体核型或CNV不一致的发生率为7.0%，因此，当MCDA双胎出现先心病，尤其两胎表型不一致时，有必要对双胎同时进行侵入性产前诊断。
联系客服
