作者：黄麦玲 王桂荣 初乃惠 李琦
单位：首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所
引用本文: 黄麦玲, 王桂荣, 初乃惠, 等. 结核性脑膜炎脑脊液实验室诊断新进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2021, 44(11) : 994-999. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20210331-00218.
摘要
结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是致死率、致残率最高的一种结核病。早期诊断能明显改善预后，但目前尚缺乏敏感、高效的诊断手段，脑脊液实验室检测对TBM的诊断至关重要。本文就TBM目前已经应用于临床的脑脊液实验室检测方法新进展及尚处于研究阶段的有潜力的脑脊液新诊断标志物进行综述，重点讨论这些诊断方法的优势和局限，为临床医生选择合适的检测方法提供参考，为新诊断方法的研究提供方向。
一、脑脊液细菌学检查方法
脑脊液中查到MTB是TBM的确诊依据，然而由于脑脊液中的MTB很少能超过1 000条/ml［8］，导致脑脊液MTB细菌学检查敏感度低。因此，脑脊液细菌学研究主要致力于提高其敏感度。 （一）抗酸杆菌涂片镜检 脑脊液涂片萋-尼氏染色检查抗酸杆菌，是最早应用于临床，也是应用最广泛的检测方法，快速、简便、价廉。然而由于该方法检测低限比较高（对于痰标本其检测低限为10 000条/ml［9］），脑脊液涂片阳性率<20%，甚至为0［10］。 近些年，无论从脑脊液的收集处理方式方法，还是从染色、显微镜技术方面都有所改进，使得部分实验室涂片阳性率明显升高。有研究表明，留取较大体积（>6 ml）脑脊液，离心后涂片，经验丰富的技术人员认真读片30 min以上，敏感度能接近60%［10］。然而在临床工作中，上述条件很难实现。另外，有研究证实反复送检脑脊液涂片检查能提高其阳性率。Kennedy和Fallon［11］报道首次脑脊液涂片及培养阳性率为37%和56%，再次送检不同标本可将总阳性率分别提高到87%和83%，但是这需要对患者进行反复的腰椎穿刺，同时随着治疗时间的延长，涂片及培养阳性率均明显下降［12］。西Feng等［13］提出了脑脊液离心涂片，并用Triton x-100破坏细胞膜抗酸染色，可观察到细胞内抗酸杆菌，这种改良抗酸染色法可将敏感度从3.3%提高到82.7%。然而，2018年一项在越南、南非、印度尼西亚共618例患者中进行的前瞻性研究发现，脑脊液涂片抗酸染色及改良抗酸染色的阳性率分别是33.9%、34.5%，改良抗酸染色并不能提高阳性率［14］，这与赵刚团队的研究结果相悖，改良抗酸染色方法对TBM的诊断价值还需要进一步研究证实。显微镜技术方面，采用氟化铬染料（金胺O或金胺-罗丹明）及强烈的光源（卤素灯或高压汞灯）的荧光显微镜较采用萋-尼氏染色及普通光源或反射光的传统光学显微镜，不但可提高痰涂片镜检敏感度，由于其采用的物镜（通常是25×）比传统的显微镜（通常为100×）放大倍数减低，使技术人员能够在更短的时间内评估同一区域的玻片，人力成本低［15］。后来，发光二极管荧光显微镜（light-emitting diode fluorescence microscope，LED-FM）因在结核病各标本中的检测敏感度高于氟化铬染料的荧光显微镜且更便宜、更节省时间，应用广泛［16］。 （二）MTB培养 脑脊液培养出MTB一直是TBM诊断的金标准。由于培养法检测出的是活菌，该方法一直是结核病疗效判断的重要指标。另外该方法后续不仅能行多种药物的药敏试验，还能为后期其他化验（例如：菌种鉴定、分子生物学检查）提供菌株，为TBM诊治提供很大帮助。目前MTB培养最常用的包括使用Middlebrook 7H9肉汤培养基的液体培养和使用罗氏（Lowenstein-Jensen，L-J）培养基的固体培养，痰液体培养较固体培养敏感度提高约10%，同时改善了药物敏感试验，但其更容易发生交叉污染，且其亦不能将MTB与非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacterium，NTM）区分开来。在所有液体培养系统中，MGIT960（Mycobacterial Growth Indicator Tube 960，Becton Dickinson，Sparks，MD美国）采用改良的Middlebrook 7H9肉汤培养基和荧光生长指示剂，是敏感性和安全性最高、全自动化、荧光、无辐射污染的方法。 由于痰培养的检测低限是100条菌/ml，无论是痰固体培养还是液体培养均较涂片敏感度提高，但仍远远不足。研究报道TBM脑脊液固体培养的敏感度是4.3%，而液体培养的敏感度为10.2%［17］。由于培养周期长，快速培养需要10~42 d，固体培养最长需要56 d，很多患者在培养结果出来之前就已经死亡，导致其早期诊断价值有限。另外，MTB培养对实验室条件要求较高，很多临床诊疗机构不能常规开展。 （三）分子生物学检测技术 脑脊液病原分子生物学检测技术主要通过核酸扩增试验（nucleic acid amplification test，NAAT）检测样本中MTB所特有的片段来协助诊断结核病，敏感度较涂片明显增高［18］，报告结果时间较培养明显缩短；同时由于操作技术的进步，促使其假阳性率明显下降，较涂片及培养其受短期治疗（5~15 d）影响较小［12］，是协助TBM诊断的有力工具。近期关于NAAT研究的系统综述和Meta分析显示以培养为诊断标准，NAAT的敏感度为82%，特异度为99%；以临床诊断为标准，NAAT的敏感度为68%，特异度为98%［18］。 1. 脑脊液Xpert MTB/RIF（Xpert）：脑脊液Xpert是美国Cepheid公司研发的一种高度自动化的诊断结核病及其利福平耐药的核酸扩增技术，较之前的涂片、培养及其他分子生物学检测技术，操作简单、敏感度高、污染少、生物安全度高，并且能2 h后报告结果。世界卫生组织（WHO）在2013年建议将Xpert用于TBM的诊断［19］。虽然脑脊液Xpert较其他诊断方法存在优势，但其诊断TBM敏感度仍然偏低。近期一项针对Xpert对TBM诊断价值的Meta分析显示，以培养为诊断标准，其敏感度仅有63%［20］，即使采用较大量脑脊液、离心后行Xpert检测，其敏感度也不够高（82%）［21］。 2. 脑脊液Xpert MTB/RIF Ultra（Xpert Ultra）：为提高检测的敏感度，Cepheid公司研发出新一代Xpert Ultra，该方法采用原来Xpert反应体系、设备的同时将PCR反应体积增加1倍；检测技术由半巢式PCR改为巢式PCR；同时新增了2条检测多拷贝序列IS6110和IS1081的探针。因此，Ultra的检出限比Xpert低8倍。2017年WHO推荐Xpert Ultra用于结核病的诊断［22］。2018年Bahr等［23］在23例合并艾滋病病毒（HIV）的确诊和很可能TBM患者中评估Xpert Ultra对TBM诊断价值，结果表明Xpert Ultra比Xpert和MGIT培养敏感度（分别为73.7%、43%和43%）明显增高。2020年，Cresswell等［24］进一步在合并HIV的确诊和高度疑似TBM患者的前瞻性研究中再次证实Xpert Ultra敏感度比Xpert及MGIT要高。然而，同年Donovan等［25］针对Xpert Ultra与Xpert对TBM的诊断价值做了一个前瞻性、随机对照研究，和此前结论不同，研究表明在临床诊断TBM（包括确诊、高度疑似和疑似TBM）的患者中，Xpert Ultra敏感度并不优于Xpert（47.2% 比39.6%，P=0.56），但无论是Xpert Ultra还是Xpert，在HIV阳性患者中的敏感度均较HIV阴性患者高。2019年Wang等［26］在43例HIV阴性临床诊断TBM中，Xpert Ultra敏感度为44.19%，明显高于Xpert（18.60%，P=0.011），2021年笔者团队扩大样本量，在76例HIV阴性临床诊断TBM患者中再次证实Xpert Ultra诊断TBM敏感度高于Xpert（45%比28%，P=0.001）［27］。目前的研究表明Xpert Ultra诊断TBM的敏感度较其他方法有所增高，但其阴性结果仍不能除外TBM，特别在HIV阴性TBM患者中其阴性预测值更低。因此，在保证特异度的同时仍需要探索诊断TBM敏感度更高的诊断方法。 3. 环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）：该技术主要是针对MTB靶基因gyrb和IS6110在恒定温度下扩增DNA的技术，该方法无需昂贵的设备和严格的实验室环境条件，具有方法简单、反应快速、高效敏感等优点，更适合在资源有限的发展中国家和基层广泛开展。可能由于该技术容易出现反应体系的污染，该方法有一定假阳性率。Sun等［28］在200例患者（临床确诊TBM172例）中评估LAMP对TBM诊断价值，敏感度（43.02%）较涂片法（2.91%）及MGIT960培养法（12.79%）明显增高，但LAMP技术诊断TBM的特异度为92.86%，有一定的假阳性率。 4. 宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）：该技术能通过一次测定就能在标本中发现一种或多种病原体。mNGS能协助诊断传统微生物学技术遗漏的中枢神经系统感染［29］。mNGS检测MTB、病毒、厌氧菌、真菌较培养存在明显优势［30］。因为增加了一步富集MTB DNA的步骤，使得mNGS可以检测到被Xpert Ultra、Xpert及液体培养遗漏的MTB DNA。2019年一项回顾性研究报道（12例确诊TBM）mNGS诊断TBM的敏感度为66.67%，明显高于涂片（33.33%）、PCR（25.00%）及培养（8.33%）［31］。最近一项关于mNGS对TBM诊断价值的Meta分析发现，在临床诊断TBM中mNGS诊断 TBM敏感度61%，特异度98%［32］。目前研究表明mNGS诊断TBM特异度高，敏感度较高，但尚无研究分析比较mNGS与Xpert Ultra对TBM诊断价值。mNGS检测需要的样本量较大（3~5 ml），检测时限较长（24 h），费用昂贵，这些都限制了其临床广泛应用。 5. GenoType MTB DRplus：该技术是一种分子线性探针技术，不仅能够检测MTB，还能通过检测异烟肼耐药基因inhA、katG及利福平耐药基因rpoB来检测异烟肼及利福平耐药情况。目前一项关于GenoType MTB DRplus诊断TBM的小样本研究发现，其诊断TBM的敏感度仅有33%，特异度98%［33］。由于其敏感度不够高，操作复杂，价格昂贵，限制了其临床应用。 6. 其他分子生物检测技术：目前，还有一些新的分子生物检测技术在一些小样本的研究中显示出较好的诊断价值，但目前还尚未应用于临床。Li等［34］在46例临床诊断TBM研究中发现脑脊液MTB游离核酸（靶基因为IS6110）的敏感度（56.5%）明显高于涂片（2.2%）、培养（13%）及Xpert（23.9%）。后来Shao等［35］纳入84例疑似TBM，以脑脊液MTB病原学阳性为诊断标准，MTB游离核酸敏感度为93.3%与Xpert Ultra一致，均高于培养（13.3%）。Li等［36］采用数字PCR方法在101例HIV阴性TBM患者中以IS6110为靶基因检测MTB，敏感度较Xpert高（70%比30%）。Ai等［37］最近采用CRISPR（contemporary Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）诊断肺结核及肺外结核不仅敏感度高，而且需要样本量少，所需时间短。该研究回顾性收集27例临床诊断TBM患者的脑脊液，结果CRISPR-MTB敏感度73%，较Xpert（54%）及培养（25%）明显增高。但这些方法还需扩大样本量，在不同人群中验证其对TBM诊断价值。
二、免疫学检测方法
1. 脑脊液抗原抗体检测：脑脊液MTB抗原抗体检测研究很早已经开展，但大部分抗原抗体敏感度及特异度不佳，限制其临床应用。2015年Cox等［38］通过在91例合并HIV的确诊TBM尸检获得的第四脑室脑脊液中，分别采用侧向流（lateral flow assay，LFA）法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脑脊液中脂阿拉伯甘露聚糖（glycolipid lipoarabinomannan，LAM）及脑脊液Xpert检查，发现其敏感度分别为75%、43%、100%，证明脑脊液LAM检测是诊断TBM有用的诊断方法。但2019年一项在赞比亚前瞻性纳入550例疑似TBM（86%合并HIV）的研究发现，以培养为金标准，脑脊液LAM（Alere LAM，Abbott，Chicago，Illinois，美国）与尿液LAM的敏感度为21.9%和24.1%，研究表明脑脊液LAM（Alere LAM）诊断TBM缺乏敏感性［39］。然而，一项新的基于高亲和力MTB特异抗体和银扩增步骤的尿液LAM［Fujifilm SILVAMP，TB LAM（Fuji LAM），Fujifilm，日本］检测低限低于上述Alere LAM方法的30倍。2019年Broger 等［40］在合并HIV的968例结核病患者中，无论以病原学阳性还是临床诊断为诊断标准，尿液Fuji LAM 较Alere LAM敏感度均明显增高（病原学阳性为诊断标准：70.4%比42.3%；临床诊断为诊断标准 64.9%比38.2%）。但是目前少见研究评估尿液或者脑脊液Fuji LAM对TBM的诊断价值。
2. 脑脊液γ-干扰素释放分析试验（interferon-gamma release assays，IGRAs）：该方法是通过检测标本中γ-干扰素水平及释放γ-干扰素的淋巴细胞数量（T-SPOT）来判断机体是否感染过MTB的方法。在过去的十几年中，许多研究针对脑脊液IGRAs对TBM诊断价值进行了评估。最近的一项系统综述和Meta分析总结分析了这些研究，血液和脑脊液T-SPOT诊断TBM敏感度分别为78%和76%，特异度为68%和88%，曲线下面积（AUC）为0.83和0.92［41］。研究结果表明，T-SPOT对TBM诊断价值有限，当该方法用于脑脊液时，特异性增强，但需要较大容量（>6 ml）脑脊液并且常出现不确定的结果（高达15%）。
3. 脑脊液腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）水平测定：一项关于ADA对TBM诊断价值的系统综述和Meta分析［42］结果显示其诊断TBM的敏感度为89%，特异度为91%。然而，在临床工作中，细菌性脑膜炎及部分病毒性脑膜炎脑脊液ADA水平与TBM相似，很难通过脑脊液ADA水平将其区分开来。另外，由于ADA对TBM诊断的cut-ofF值尚未确定，导致其结果的解读存在困难。
三、基于组学的诊断标志物的筛选
近20年，组学技术发展快速，为TBM寻找疾病诊断生物标志物提供了新的契机。由于TBM较其他脑膜炎因为病原菌及致病机制的不同，导致脑脊液中可能存在TBM所特有的生物标志物，这为组学技术在脑脊液中寻找生物标志物打下基础，这些标志物可能成为疾病诊断的分子标记。
1. 脑脊液蛋白组学：目前国内外关于TBM脑脊液蛋白组学的研究仅3个，2011年，Kataria等［43］将脑脊液蛋白组学应用于TBM的研究，发现19个差异蛋白，并进一步筛选、通过Western blot发现花生四烯酸5-脂氧合酶（arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX-5）对TBM有潜在诊断价值。2013年，复旦大学医学院Ou等［44］通过蛋白组学发现9个差异蛋白，进一步通过ELISA验证发现TBM组钙离子结合蛋白A8（S100 calcium-binding protein A8，S100A8）、载脂蛋白B-100（lipoprotein B-100，APOB）较隐球菌脑膜炎与健康对照组有差异。2015年重庆医科大学Mu等［45］采用相同技术发现两组有111个差异蛋白，进一步通过Western blot、ELISA验证，发现神经表皮样生长因子2（neural epidermal growth factor-like like 2，NELL2）、载脂蛋白-B（lipoprotein-B，APOB）有望成为TBM诊断蛋白标志物。但是这些研究仅筛选2~3个候选蛋白通过Western blot或ELISA验证。研究样本量少，对照组病种单一，且主要为健康对照。因此，需要扩大样本量、增加对照组疾病种类对筛选出的蛋白进行独立验证。
2. 脑脊液代谢组学：2017年Li等［46］基于1H核磁共振的代谢组学发现了25个代谢物（涉及氨基酸、碳水化合物、脂质、核苷代谢）在TBM与病毒性脑膜炎脑脊液水平存在差异，可能是TBM潜在诊断标志物，但尚需扩大样本量、增加疾病种类进行进一步的验证。最近一项对33例HIV阴性临床诊断TBM患者脑脊液及血液代谢组学的研究［47］发现，TBM组脑脊液中有250个代谢物水平高于非TBM组，TBM组血液中有5个代谢物与非TBM组水平存在差异，TBM组患者脑脊液及血色氨酸水平较对照组低，通过进一步独立验证，TBM死亡组较非死亡组色氨酸水平高，提示色氨酸有可能成为TBM诊断及预后标志物。但是该研究为单中心研究，其研究对象来自一个种族人群，在研究成果转化临床前，还需要扩大样本量多中心研究结果的支持。
3. 脑脊液转录组学：微小RNA（miRNA）是一类保守的非编码小RNA（21~25个核苷酸长度），在基因表达调控等生物学方面起着重要作用。在一项包括112例TBM患儿和130名健康对照者的研究［48］中，外周血单个核细胞及脑脊液中miR-29a诊断TBM敏感度分别为67.2%、81.1%，特异度为88.5%、90.0%，脑脊液结合外周血单个核细胞检测miR-29a诊断 TBM的敏感度为84.4%，特异度为95.4%，研究表明miR-29a有可能成为儿童TBM有潜在诊断价值的标志物，但miR-29a在其他常需要与TBM进行鉴别的细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎及脑膜肿瘤等疾病中的表达水平如何，目前罕见研究报道。2019年Pan等［49］通过全基因组miRNA微阵列发现miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p在TBM与病毒性脑膜炎外周血单个核细胞及脑脊液表达水平有差异，但这3个miRNA在其他需要与TBM进行鉴别诊断的疾病的脑脊液中表达水平如何，仍需进一步研究探索。
综上，TBM的确诊还是依赖于脑脊液病原学检测，然而，即使采用目前诊断TBM敏感度最高的Xpert Ultra，其阴性结果仍不能除外TBM。因此，继续寻找提高细菌学检查敏感度方法的同时积极通过高通量组学寻找协助诊断TBM的方法不失为一种好的策略。但是目前组学研究结果大部分都局限在早期标志物的筛选方面，需要扩大样本量，选取不同严重程度TBM、不同对照组疾病种类、不同地区种族人群的多中心研究进行独立样本的验证。
参考文献（略）
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