现在认为肿瘤内异质性（ITH）是导致治疗失败和纠正性的关键因素，在癌症研究中引起了越来越多的关注。在这里，我们介绍一个R包MesKit，用于识别癌症基因组ITH并推断肿瘤进化的历史。MesKit通过实施公认的计算和统计方法，提供了广泛的分析，包括ITH评估，富集，签名，克隆进化分析。可以通过Github上（https://github.com/Niinleslie / MesKit）免费获得源代码和文档。我们还开发了一个闪亮的应用程序，以提供更轻松的分析和可视化。
在R控制台中，输入citation("MesKit")。
MesKit：通过体细胞突变从多区域衍生的肿瘤活检病理解剖癌症演变的工具套件（已提交）
要使用MesKit进行分析，您需要提供：
来自患者的多区域样本的MAF文件（*.maf / *.maf.gz）。需要
体细胞突变的血浆分数（CCF）数据。任选，但推荐
分割文件。任选的
GISTIC输出。任选的
注意： Patient_ID和Tumor_Sample_Barcode分别在所有输入文件中保持一致。
突变注释格式（MAF）文件是制表符分隔的文本文件，其中包含来自VCF文件的汇总突变信息。MesKit的输入MAF文件（或“* .maf.gz”）具有应基于标准MAF文件命名为Patient_ID状语从句：的其他列Tumor_ID。此外，该关于Variant_Classification列，可以在“ 突变注释格式页面”中找到网求允许的值。
MesKit的MAF文件中必须包含以下字段。
必须填写：
Hugo_Symbol，Chromosome，Start_Position，End_Position，Variant_Classification，Variant_Type，Reference_Allele，Tumor_Seq_Allele2，Ref_allele_depth，Alt_allele_dept，VAF，Tumor_Sample_Barcode，Patient_ID，Tumor_ID
注意：单个肿瘤的多区域样品标有相同的标记Tumor_ID，例如“原发性”，“转移性”和“淋巴性” 此外，该Hugo_Symbol字段中的值。不一定来自HUGO数据库MAF文件示例
## Hugo_Symbol Chromosome Start_Position End_Position Variant_Classification## 1 CFAP74 1 1880545 1880545 Intron## 2 TFAP2A 6 10159520 10159520 IGR## 3 IGSF21 1 18605309 18605309 Intron## Variant_Type Reference_Allele Tumor_Seq_Allele2 Ref_allele_depth## 1 SNP C A 16## 2 SNP T A 29## 3 SNP A C 144## Alt_allele_depth VAF Tumor_Sample_Barcode Patient_ID Tumor_ID## 1 3 0.1578 T1 HCC5647 Primary## 2 17 0.3695 T1 HCC6952 Primary## 3 19 0.1165 T4 HCC8031 Primary
默认情况下，有在输入CCF文件6个强制字段：Patient_ID，Tumor_Sample_Barcode，Chromosome，Start_Position，CCF和CCF_std/ CCF_CI_High。（识别何时克隆/亚克隆突变需要）ChromosomemafFile和ccfFile的字段应采用格式（数字或两者均以“CHR”开头）。某些的，如果CCF文件包含其他变种除了一个SNV，Reference_Allele而且Tumor_Seq_Allele2也应包括在输入CCF文件。
CCF文件示例
## Patient_ID Tumor_Sample_Barcode Chromosome Start_Position CCF## 1 HCC5647 T4 22 43190575 0.6112993## 2 HCC5647 T5 22 43190575 0.6239556## 3 HCC5647 T3 22 43190575 0.5121414## 4 HCC5647 T1 22 43190575 0.6891924## 5 HCC5647 T4 5 178224614 0.7668806## CCF_Std## 1 0.19713556## 2 0.19523997## 3 0.17751275## 4 0.21622254## 5 0.09085722
分段文件是制表符分隔的文件，具有以下6或7列：
Patient_ID -患者编号
Tumor_Sample_Barcode -样品的肿瘤样品滤液
Chromosome -染色体名称或ID
Start_Position -片段的基因组起始位置（1索引）
End_Position -片段的基因组末端位置（1索引）
Segment_Mean/CopyNumber -段两端或绝对整数副本数
注意：位置以碱基对为单位。
分割文件示例
## Patient_ID Tumor_Sample_Barcode Chromosome Start_Position End_Position## 1 HCC5647 T1 1 138488 6479452## 2 HCC5647 T1 1 6504488 120906360## 3 HCC5647 T1 1 144921930 157805992## 4 HCC5647 T1 1 157809143 160394321## 5 HCC5647 T1 1 160604266 165877230## CopyNumber## 1 2## 2 2## 3 6## 4 2## 5 8
通过在R控制台中键入以下命令来安装此后续的最新版本：
install.packages("devtools")devtools::install_github("Niinleslie/MesKit")if(!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")BiocManager::install("MesKit")readMaf函数通过读取MAF文件和分数分数（CCF）数据创建Maf / MafList对象（可选，但建议使用）。参数设置refBuild参照基因组版本智人参考（"hg18"，"hg19"或"hg38"）。
library(MesKit)
maf.File <- system.file("extdata/", "HCC_LDC.maf", package = "MesKit")ccf.File <- system.file("extdata/", "HCC_LDC.ccf.tsv", package = "MesKit")# Maf object generationmaf <- readMaf(mafFile = maf.File, refBuild = "hg19") # Maf object with CCF informationmaf <- readMaf(mafFile = maf.File, ccfFile = ccf.File, refBuild = "hg19")为了通过多区域测序方法探索癌症进展过程中的基因组变化，我们提供classifyMut了对突变进行分类照片的功能。分类基于突变的共享模式或克隆状态（需要CCF数据），可以通过class选项对话指定。另外，classByTumor可用于揭示肿瘤内的突变情况。
# Driver genes of CRC collected from [IntOGen](https://www.intogen.org/search) (v.2020.2）driverGene.file <- system.file("extdata/", "IntOGen-DriverGenes_HC.tsv", package = "MesKit")driverGene <- as.character(read.table(driverGene.file)$V1)mut.class <- classifyMut(maf, class = "SP", patient.id = 'HCC8257')head(mut.class)Patient_ID <chr> | Tumor_Sample_Barcode <chr> | Mut_ID <chr> | Mutation_Type <chr> |
|---|---|---|---|
| HCC8257 | T1 | TAS1R1：1：6634701：C：T | 上市 |
| HCC8257 | T1 | HNRNPCL1：1：12907313：G：A | 上市 |
| HCC8257 | T1 | HNRNPCL2：1：13183165：T：C | 共享 |
| HCC8257 | T1 | HNRNPCL2：1：13183168：A：G | 共享 |
| HCC8257 | T1 | EPHA2：1：16462250：C：T | 上市 |
| HCC8257 | T1 | RUNX3：1：25291140：-：T | 共享 |
plotMutProfile 功能可以可视化肿瘤样品的突变谱。
# specify the order of patients and samples via "patient.id" and "sampleOrder" respectivelypatientOrder <- c("HCC5647", "HCC6690", "HCC6046")sampleOrder <- list("HCC5647" = c("T1", "T4", "T5", "T3"))plotMutProfile( maf, patient.id = patientOrder, sampleOrder = sampleOrder, class = "SP", geneList = driverGene)该plotCNA功能可基于来自分割算法的拷贝数据数据样本中的CNA布局。转换，MesKit还提供了集成的GISTIC2结果的选项，可以从http://gdac.broadinstitute.org获得。请确保基于这些结果的基因组版本与refBuildMaf / MafList对象一致。
# Read segment filesegCN <- system.file("extdata", "HCC_LDC.seg.txt", package = "MesKit")# Reading gistic output filesall.lesions <- system.file("extdata", "LIHC_all_lesions.conf_99.txt", package = "MesKit")amp.genes <- system.file("extdata", "LIHC_amp_genes.conf_99.txt", package = "MesKit")del.genes <- system.file("extdata", "LIHC_del_genes.conf_99.txt", package = "MesKit")seg <- readSegment(segFile = segCN, gisticAllLesionsFile = all.lesions, gisticAmpGenesFile = amp.genes, gisticDelGenesFile = del.genes)## --Processing LIHC_amp_genes.conf_99.txt## --Processing LIHC_del_genes.conf_99.txt## --Processing LIHC_all_lesions.conf_99.txt
seg$HCC8257[1:5, ]
Patient_ID <chr> | Tumor_Sample_Barcode <chr> | 染色体 <chr> | 开始位置 <dbl> | 结束位置 <dbl> | |
|---|---|---|---|---|---|
| HCC8257 | T1 | 1个 | 12080 | 6587004 | |
| HCC8257 | T1 | 1个 | 6589061 | 39571446 | |
| HCC8257 | T1 | 1个 | 247655354 | 248903200 | |
| HCC8257 | T1 | 2 | 219618270 | 242946660 | |
| HCC8257 | T1 | 3 | 47953954 | 87100426 |
plotCNA(seg, patient.id = c("HCC5647", "HCC8257", "HCC6690"))该mathScore函数使用突变等位基因肿瘤异质性（数学）方法1估算每个样品的ITH 。通常，MATH评分越高，肿瘤样本的异质性越强2 3。对于MRS，此函数可以根据合并的VAF预算肿瘤内的MATH轰炸withTumor = TRUE。
# calculate MATH score of each sampleMATH.sample <- mathScore(maf)MATH.sample
Patient_ID <chr> | Tumor_Sample_Barcode <chr> | MATH_Score <dbl> |
|---|---|---|
| HCC5647 | T1 | 57.263 |
| HCC5647 | T3 | 57.673 |
| HCC5647 | T4 | 55.059 |
| HCC5647 | T5 | 57.612 |
| HCC6046 | T1 | 91.096 |
| HCC6046 | T2 | 94.129 |
| HCC6046 | T3 | 88.884 |
| HCC6046 | T4 | 92.266 |
| HCC6046 | T5 | 83.884 |
| HCC6690 | T1 | 58.015 |
该ccfAUC功能通过每个肿瘤的所有癌细胞组分的累积密度曲线下面积（AUC）估算肿瘤异质性。具有较高的AUC值的肿瘤被认为是异质性4。如果MAF数据包含来自多个患者的信息，则可以通过指定相应的患者ID进行子集。
AUC <- ccfAUC(maf, patient.id = 'HCC8257')names(AUC)
## [1] "AUC.value" "CCF.density.plot"
AUC$AUC.value
Patient_ID <chr> | Tumor_Sample_Barcode <chr> | AUC <dbl> |
|---|---|---|
| HCC8257 | T1 | 0.3113410 |
| HCC8257 | T2 | 0.2823868 |
| HCC8257 | T3 | 0.3524984 |
| HCC8257 | T4 | 0.4334707 |
| HCC8257 | T5 | 0.1766210 |
# show cumulative density plot of CCFAUC$CCF.density.plot
vafCluster函数将基于高斯有限混合模型对变异等位基因频率（VAF）进行聚类。此功能将生成一个密度分布图，从而具有不同的VAF的突变簇。我们将簇数视为ITH的简单指标。另外，该功能可以读取分段文件来调整CNA和LOH。
clusterVaf <- vafCluster(maf, patient.id = 'HCC8257')head(clusterVaf$cluster.data[, -1])
染色体 <chr> | 开始位置 <int> | 结束位置 <int> | Variant_Classification <chr> | |
|---|---|---|---|---|
| 1个 | 6634701 | 6634701 | Missense_Mutation | |
| 1个 | 12907313 | 12907313 | Missense_Mutation | |
| 1个 | 16462250 | 16462250 | Missense_Mutation | |
| 1个 | 25291140 | 25291140 | Frame_Shift_Ins | |
| 1个 | 27101098 | 27101098 | 无声 | |
| 1个 | 39879366 | 39879366 | 无声 |
clusterPlots <- clusterVaf$cluster.plotcowplot::plot_grid(plotlist = clusterPlots)
固定指数（Fst）是人口遗传学的经典指标，可用于基准5 6 7地区之间的遗传差异。calFst函数计算由人群之间的频率差异引起的等位基因频率总方差的比例。
calFst(maf, patient.id = 'HCC8257', plot = TRUE, number.cex = 10)
## $Fst.avg## [1] 0.1281842## ## $Fst.pair## T1 T2 T3 T4 T5## T1 1.0000000 0.1296320 0.11644355 0.12351694 0.1556410## T2 0.1296320 1.0000000 0.14284173 0.14535748 0.1663971## T3 0.1164435 0.1428417 1.00000000 0.04238276 0.1389207## T4 0.1235169 0.1453575 0.04238276 1.00000000 0.1207090## T5 0.1556410 0.1663971 0.13892069 0.12070896 1.0000000## ## $Fst.plot
该函数calNeiDist针对每个样本对8计算来自同一患者的多区域样本之间的CCF的Nei 距离，以考虑到内部内部的异质性来评估人群之间的相似性。。
calNeiDist(maf, patient.id = 'HCC8257', number.cex = 10)
## $Nei.dist.avg## [1] 0.3439051## ## $Nei.dist## T1 T2 T3 T4 T5## T1 1.0000000 0.3510825 0.2769709 0.3103000 0.4612432## T2 0.3510825 1.0000000 0.3260584 0.3492942 0.4917281## T3 0.2769709 0.3260584 1.0000000 0.1393114 0.3798806## T4 0.3103000 0.3492942 0.1393114 1.0000000 0.3531822## T5 0.4612432 0.4917281 0.3798806 0.3531822 1.0000000## ## $Nei.plot
尽管转移灶具有重要的临床意义，但仍知之甚甚少，并且对转移过程的了解可以为临床治疗提供补充信息。
根据样本/肿瘤对之间的体细胞突变的血浆分数（CCF）的植入与多克隆植入的不同模式。compareCCF函数返回突变的成对对CCF的结果列表，该列表在少量患者的样本之间进行标识。最近，该方法已被广泛使用的不同成对对肿瘤突变之间的潜在转移途径9 10。
ccf.list <- compareCCF(maf)ccf.pairwise <- ccf.list$HCC8257[["T3-T4"]]# compare CCF using smoothScattergraphics::smoothScatter(matrix(c(ccf.pairwise[,3], ccf.pairwise[,4]),ncol = 2), xlim = c(0,1), ylim = c(0,1), colramp = colorRampPalette(c("white", RColorBrewer::brewer.pal(9,"BuPu"))), xlab = "T3", ylab = "T4")## show driver genesgene.idx <- which(ccf.pairwise$Hugo_Symbol %in% driverGene) points(ccf.pairwise[gene.idx, 3:4], cex=0.6, col=2, pch=2)text(ccf.pairwise[gene.idx, 3:4], cex=0.7, pos=1, ccf.pairwise$Hugo_Symbol[gene.idx])title('HCC8257', cex.main = 1.2)雅克卡相似度指数（JSI）可用于计算区域之间的突变相似度，这被定义为样本对11的共享变量与所有变异的比率。用户可以通过compareJSI功能分开转移灶（包括淋巴结转移灶和远处转移灶）中的单克隆与多克隆播种，并且更高的JSI值表明多克隆播种的可能性更高12。
JSI.res <- compareJSI(maf, plot = FALSE, patient.id = 'HCC8257') names(JSI.res)
## [1] "JSI.multi" "JSI.pair"
# show the JSI resultJSI.res$JSI.multi
## [1] 0.439441
JSI.res$JSI.pair
## T1 T2 T3 T4 T5## T1 1.0000000 0.58333333 0.5757576 0.5416667 0.08771930## T2 0.5833333 1.00000000 0.4736842 0.4810127 0.07692308## T3 0.5757576 0.47368421 1.0000000 0.8734177 0.19565217## T4 0.5416667 0.48101266 0.8734177 1.0000000 0.20454545## T5 0.0877193 0.07692308 0.1956522 0.2045455 1.00000000
肿瘤的亚克隆突变体等位基因频率遵循由中性生长13预测的简单幂律分布。用户可以通过该testNeutral功能在强大选择下评估肿瘤是否遵循中性进化。R2> = R2.threshold（默认值：0.98）的肿瘤被认为遵循中性进化。此外，将如果参数plot设置为，则此函数还可以生成每个样本的模型拟合图TRUE。
neutralResult <- testNeutral(maf, min.mut.count = 10, patient.id = 'HCC8257')neutralResult$neutrality.metrics
Patient_ID <chr> | Tumor_Sample_Barcode <chr> | Eligible_Mut_Count <int> | 区 <dbl> | |
|---|---|---|---|---|
| HCC8257 | T1 | 25 | 0.4928217 | |
| HCC8257 | T2 | 26 | 0.4986444 | |
| HCC8257 | T3 | 69 | 0.3219492 | |
| HCC8257 | T4 | 48 | 0.3738832 |
neutralResult$model.fitting.plot$T3
使用MesKit，每个个体的系统发育树合并都是基于所有肿瘤区域中突变的二进制存在/不存在矩阵。
基于Maf对象，getPhyloTree函数以不同的方法重建系统树，包括“ NJ”（Neibor-Joining）， “ MP”（最大简约），“ ML”（最大似然），“ FASTME.ols”和“ FASTME.bal”。”，可以通过控制method参数进行设置。系统开发树将存储在一个phyloTree/phyloTreeList对象中，以后可用于功能探索，突变特征分析和树的可视化。
phyloTree <- getPhyloTree(maf, patient.id = "HCC8257", method = "NJ", min.vaf = 0.06)
系统进化树之间的比较可以揭示肿瘤进化的共识模式。该compareeTree函数计算通过不同方法构造的系统-发育树之间的距离，并treedist从phangornř包报道查看所有游戏四个距离的向量。有关详细信息，请参见treedist。
tree.NJ <- getPhyloTree(maf, patient.id = 'HCC8257', method = "NJ")tree.MP <- getPhyloTree(maf, patient.id = 'HCC8257', method = "MP")# compare phylogenetic trees constructed by two approachescompareTree(tree.NJ, tree.MP, plot = TRUE)
## Both tree have 2 same branches
## $compare.dist## Symmetric.difference KF-branch distance Path difference ## 2.000000 67.877750 2.828427 ## Weighted path difference ## 234.424473 ## ## $compare.plot
该phyloTree对象可以进行进一步的进行功能探索。下面是一个示例，说明如何通过从聚类树对象中提取某些类别的基因，通过ClusterProfiler进行KEGG富集分析。
library(org.Hs.eg.db)library(clusterProfiler)# Pathway enrichment analysisHCC8257.branches <- getMutBranches(phyloTree)# pathway enrichment for public mutated genes in patient HCC8257HCC8257_Public <- HCC8257.branches[HCC8257.branches$Mutation_Type == "Public", ]geneIDs = suppressMessages(bitr(HCC8257_Public$Hugo_Symbol, fromType="SYMBOL", toType=c("ENTREZID"), OrgDb="org.Hs.eg.db"))KEGG_HCC8257_Public = enrichKEGG( gene = geneIDs$ENTREZID, organism = 'hsa', keyType = 'kegg', pvalueCutoff = 0.05,)dotplot(KEGG_HCC8257_Public)可使用“ mut_matrix”从相应的参考基因组中检索到取代的取代的序列背景，以并具有所有96个三核苷酸变化计数的突变矩阵。随后，可以使用“ plot_spectrum”替换6个取代的类型的光谱，该光谱可以分为几个样本组。
mutTrunkBranch函数计算出现在六种类型的二进制取代类型（C> A，C> G，C> T，T> A，T> C，T> G）中的每一种中发生的离散/固有突变的比例，并进行双向费舍尔的精确测试。为C> T的突变，也可以进一步分为C> T在CpG的位点和其他站点通过设置CT = TRUE。此功能提供plot了打印分支/突变树干的分布选项对话。主干和分支突变之间具有显着差异的替代类型用星号标记。
# load the genome referencelibrary(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19)
mutClass <- mutTrunkBranch(phyloTree, CT = TRUE, plot = TRUE)names(mutClass)
## [1] "mutTrunkBranch.res" "mutTrunkBranch.plot"
mutClass$mutTrunkBranch.res
Patient_ID <chr> | 组 <chr> | 树干 <dbl> | 科 <dbl> | P_值 <dbl> |
|---|---|---|---|---|
| HCC8257 | C> | 0.13846154 | 0.16013072 | 0.85080447 |
| HCC8257 | C> G | 0.10769231 | 0.07189542 | 0.31491629 |
| HCC8257 | CpG的C> T | 0.16923077 | 0.10130719 | 0.13127686 |
| HCC8257 | C> T其他 | 0.33846154 | 0.33660131 | 1.00000000 |
| HCC8257 | > | 0.00000000 | 0.07189542 | 0.01932983 |
| HCC8257 | > | 0.16923077 | 0.21241830 | 0.50121380 |
| HCC8257 | > | 0.07692308 | 0.04575163 | 0.34815341 |
mutClass$mutTrunkBranch.plot
triMatrix函数根据每个样品的体表SNV返回96个三核苷酸的突变计数矩阵。该fitSignatures函数将矩阵状语从句：已知签名矩阵作为输入侧，以找到最佳的突变签名非负线性组合，以重建矩阵并基于体，SNV计算余弦相似度。变量，签名矩阵可以指定（或）"cosmic_v2"，也可以由用户通过提供。"exome_cosmic_v3""nature2013"signaturesRef
trimatrix_HCC8257 <- triMatrix(phyloTree, withinTumor = TRUE)fit_HCC8257 <- fitSignatures(trimatrix_HCC8257)
plotMutSigProfile 可以利用功能来可视化96个三核苷酸突变图或重建的突变图。
# Visualize the 96 trinucleodide mutational profileplotMutSigProfile(trimatrix_HCC8257)[[1]]
# Compare the reconstructed mutational profile with the original mutational profileplotMutSigProfile(fit_HCC8257)[[1]]
# Below plot shows cosine similarities between the mutational profile of each group and COSMIC signatureslibrary(ComplexHeatmap)ComplexHeatmap::Heatmap(fit_HCC8257$HCC8257$cosine.similarity, name = "Cosine similarity")
用户可以通过plotPhyloTree功能可视化带有注释的系统发育树。通过指定branchCol参数，可以根据突变的分类或相对应的已知特征进行分区着色。show.bootstrap提供了参数以显示内部互连的支持值。从而，通过mutHeatmap功能，用户可以二进制突变热图（指示突变的存在或不存在）或CCF热图都可以通过运行mutHeatmap函数显示。
# A phylogenetic tree along with binary and CCF heatmap of mutations phylotree_HCC8257 <- plotPhyloTree(phyloTree)heatmapbinary_HCC8257 <- mutHeatmap(maf, use.ccf = FALSE, patient.id = "HCC8257", min.vaf = 0.06)heatmapCCF_HCC8257 <- mutHeatmap(maf, use.ccf = TRUE, patient.id = "HCC8257", min.vaf = 0.06)cowplot::plot_grid(phylotree_HCC8257, heatmapbinary_HCC8257, heatmapCCF_HCC8257, nrow = 1, rel_widths = c(1.3, 1, 1))
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