质粒DNA提取实验

一、材料与试剂准备

1.  材料：大肠杆菌。

2.  仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。

3.  试剂：

（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。

（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。

（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。

（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。

（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。

二、操作步骤

1.  细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。

2.  离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。

3.  沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

4.  重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。

5.  加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

6.  加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。

7.  加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。

8.  离心10 min，12 000 rpm，4℃。

9.  取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。

10.  加入40 ul，3 M NaAc。

11.  酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

12.  离心10 min，12 000 rpm，4℃。

13.  取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14.  电泳检测提取DNA的质量。