重组Cre融合蛋白的表达及蛋白转导效率研究

【摘要】：蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递。TAT蛋白转导域(TAT-PTD)是源自人类免疫缺陷病毒HIV1蛋白的一段碱性氨基酸多肽,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,在药物转运和疾病治疗等领域有着巨大的应用潜力。 来源于噬菌体P1的Cre/loxP系统目前已被广泛用于原核、真核生物体内与体外DNA重组方面的研究，并且在基因功能的鉴定、特定基因的删除、染色体工程、基因捕获以及外源基因的整合等方面发挥着巨大功能。 为了获得穿膜效率高的Cre融合蛋白，将Cre基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)，使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段和来源于SV40大T抗原的核定位信号NLS序列，插入到Cre重组酶编码区DNA的C-末端或者N-末端，组成不同构象的重组表达子。将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行IPTG诱导使得重组Cre融合蛋白表达，利用组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白，用包含Cre功能检测元件的293-C31-L2GFP细胞系，对纯化出的融合蛋白进行活性检测，观察各个融合蛋白的作用效果，并用流式细胞仪检测效率。结果表明: 1、以质粒pCAG-Cre-IP为模板，用PCR的方法扩增出Cre基因的开放阅读框序列。利用基因重组技术将目的基因克隆到pMD19-T载体上，转化感受态大肠杆菌（DH5α），测序正确后连接于原核表达载体pET-28a(+)多克隆位点，构建含有Cre、TAT及NLS序列的11个原核表达载体。 2、利用0.7mM IPTG在28℃条件下诱导7h，11个原核表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)进行原核诱导表达，用组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白并进行Western blot鉴定，最后得到高纯度的Cre融合蛋白。 3、细胞穿膜实验结果表明，在11个重组表达子中，His-NLS-TAT-Cre (HNTC)融合蛋白的穿膜效率最高，核定位效果理想，可作为哺乳动物染色体水平上基因操作的工具。