PCR 作为猪的诊断工具 ：1、基础知识

使用PCR检测(聚合酶链反应）是当今养猪生产医学中最常用的诊断工具之一。它不仅用于诊断，而且还用作通过监测疾病、监测改善生物安全的手段。因此，在解释结果时，了解此类技术的优缺点至关重要。同样重要的是，相同的技术用于不同的病原体，结果方面会存在差异。

一、检测原理

PCR检测用于检测细菌或病毒的遗传物质（DNA或RNA）。该过程从从样品中提取DNA或RNA开始，然后通过扩增循环。如果靶物质是RNA，第一步将是将RNA转化为DNA（技术上称为cDNA）。热循环旨在创建1变性、2退火、3延伸的3步过程，这导致样品中存在的DNA的复制。因此，对于每个周期（1 Ct），假设效率为100%，则存在两倍于DNA的存在。然后，目标是继续扩增过程，直到检测到足够的DNA以使样品检测呈阳性或长达30-40个周期，具体取决于所用特定测定的设计。

PCR的机理示意图。

二、提取检测对象

提取过程是PCR测定的关键步骤，因为它会影响测试样品中遗传物质的数量和质量。对检测的样品类型（血清、口腔液、组织等）使用适当的提取过程至关重要。扩增过程（退火过程）的步骤2需要使用引物，这些引物是DNA序列的短片段，专门设计用于仅附着并帮助复制所关注的靶向病原体的特定基因序列。对于在基因上不断变异的病原体（例如PRRS病毒），必须定期更新这些引物以确保仍然检测到新毒株。

三、结果读取

确定检测周期截止点（通常在30-40左右），是因为认识到如果扩增过程继续，最终由于自发退火和延伸，测定将变得阳性。这表明，在解释结果时，尤其是在疫情结束时，需要特别考虑弱阳性结果、接近临界值的高Ct值。

在猪医学中有两种不同的PCR测定方法。传统的基于凝胶的PCR和更现代的实时荧光定量PCR。两种测定的工作原理相同，都依赖于DNA或RNA的扩增。不同之处在于，基于凝胶的测定仅在测定结束时“读取”一次，而使用实时PCR，测定结果在每个循环后被“读取”。实时荧光定量 PCR 的优点是它允许定量/半定量结果。

四、合样检测

PCR检测由于其在样品中扩增遗传物质的过程，具有检测样品中少量遗传物质（分析灵敏度）的极强能力。这提供了通过合并样本评估多个样品的机会。重要的是要记住，根据定义，合并会稀释所评估的样品。当特定病原体的预期浓度很高时（特别是在疾病的早期爆发中），这应该不是问题。当阳性样本中的病原体浓度较低时，例如在疾病暴发结束时或预计已经稀释的样本类型（口腔液）上，合样检测可能是一个问题。