罗正中 四川农业大学动物医学院博士研究生
张廷青 博士
本文是“如何评估OPU/IVF胚胎质量优劣？”系列文章最后一篇，首先重点介绍异常胚胎，虽然这些异常胚胎大部分不可进行鲜胚移植或冷冻保存，但依然少部分可进行正常鲜胚移植或冷冻保存，但仅限于就地或本国使用，不允许出口其它国家。其次，为检验同道们学习效果如何，我们提供了数十个不同发育阶段和质量的胚胎供大家自测，同时提供正确答案。再其次，鉴于目前我国OPU/IVF生产胚胎即将进入商业化运作，有必要藉助国际通用认可标准对我国自产类似胚胎进行适当标识和提供相应信息及生产证书。最后，我们简述我国目前商业化OPU/IVF生产胚胎技术自主研发和推广普及的阶段性进展与成果。
图1.左上分图示两个不同发育阶段的胚胎（100xDIC）：左下侧为一个未受精卵细胞，在其12点钟位点有一小的凸出透明带开始剥离；而右上侧为一个2级早期桑葚胚（3-2），其透明带呈椭圆形，在7点钟位点的透明带即使未撕裂但也已经变薄，黄色线条标示区域为健康卵裂球融合团块，其周缘存在若干挤出的死亡卵裂球，据此也可将该桑葚胚质量定为3级（3-3）。中上分图示两个未受精卵细胞（100xDIC）：均具有畸形透明带，还能发现子宫内膜细胞粘附透明带外表面（OPU/IVF生产的胚胎不会出现这种现象）；假定这是两个健康的桑葚胚，但如果不进行适当清洗和用胰蛋白酶溶液彻底去除这些细胞碎片，将不允许出口其它国家。右上分图示从一头供体采集到的六个7.5日龄胚胎（100xDIC）：除中间的那个4细胞退化胚胎外，其余卵细胞或胚胎均具有畸变透明带；紧邻这个4细胞退化胚胎左下方和右下方为透明带呈撕裂形状的未受精卵细胞；而最左侧是一个3级囊胚（6-3），在该胚胎透明带2点钟位点有一乳头状凸起和一个较大裂纹；此外，该胚胎胚体大小与正常发育7.5日龄胚胎胚体相比来说较小，但囊胚腔比内细胞团大；最右侧下方是一个2级早期囊胚（5-2），缘于在该胚胎4点钟位点透明带存在瑕疵，所以质量等级由1级降为2级。左下分图黄色箭头所示为嵌入透明带内呈深色折痕的带状精子（Zonary Sperm），这是因为第一个精子穿过透明带与卵黄膜融合后导致透明带即刻闭锁，所以这些未 “捷足先登” 的精子被困裹在透明带内；这些胚胎并非异常胚胎，但在一组胚胎中观察到这么多带状精子现象确实罕见。右下分图增强背景色彩对比，黄色箭头所指可清楚观察到带状精子（透明带内的深色虚线）；左下角胚胎透明带内无见带状精子。
图2.左上分图示同一供体冲卵回收的一细长组织块及其附近的所有高质量胚胎（40倍立体显微镜放大；OPU/IVF生产的胚胎不会出现这种现象）：该组织块内含有大量卵丘细胞：黄色箭头所指是包裹在该组织块内的4个卵细胞或胚胎；用两枚细长20号针头仔细进行手工操作，将这些卵细胞或胚胎从该组织块内剥离出来，可发现其中的某些胚胎可能是健康的活胚胎，就像包裹于组织块的其它胚胎一样，这些剥离出来的健康活胚胎同样可以进行鲜胚移植和冷冻保存，效果均佳。中上分图示一个无透明带的1级早期囊胚（5-1）和一个破裂的透明带（100xDIC）：该胚胎冲卵回收过程中透明带被撕裂，在透明带11点钟位点可观察到严重破损或撕裂，在透明带6点钟位点可看到少量残存卵质；有时这种破损或撕裂非常细微而难以发现，因而常常被误导判定为一个缺失卵质的空壳透明带卵细胞；空壳透明带往往见于冲卵回收流程压力过高和子宫角被反复过度操弄所致；右下角是一个无透明带裸露的1级早期囊胚（5-1；实际是胚体），鲜胚移植效果良好，亦可冷冻保存，但禁止出口其它国家。右上分图示中上分图那个空壳透明带放大400倍的细微结构（400xDIC）：实践中，如果发现空壳透明带很薄，这可能是胚胎已经孵化迹象，或扩张囊胚透明带已被切开并强行孵化；无论是前者或后者，均需仔细寻找那个逸出透明带的胚体，该胚体可就地进行鲜胚移植或冷冻保存，但禁止出口。左下分图示一个未受精卵细胞嵌入卵丘细胞基质中（蓝色箭头标示；40xBF）：有趣的是这些嵌入的卵细胞依然可以穿经输卵管并到达子宫（OPU/IVF生产的胚胎不会出现这种现象）。左下中分图示一个空壳透明带（400xDIC）：在该透明带2点钟至4点钟区域存在严重破裂并扩展延伸至卵子中心；仔细检视可观察到该透明带具有多孔性（黄色箭头标示处），不言而喻，透明带具有多孔性自然可以允许卵丘细胞丝穿越而与卵质进行信息交流。右下中分图示采集的若干卵细胞/胚胎被中性粒细胞侵入透明带表面（红色箭头标示；40xBF；OPU/IVF生产的胚胎不会出现这种现象）：粘附在透明带表面的中性粒细胞像小结节，但其它卵子/胚胎似乎未受影响；透明带粘附中性粒细胞提示输卵管或子宫被细菌感染，这些胚胎照样可以成功地进行鲜胚移植；可以尝试用微量移液器在显微镜下往复漩涡这些胚胎，藉以去除中性粒性细胞；然而，这些胚胎不可出口其它国家。右下分图示不同类型的卵细胞/胚胎（100xDIC）：大多数是未受精卵细胞或退化胚胎；黄色箭头标示的胚胎是可进行移植的；黄色箭头所指最上方那个胚胎为2级早期囊胚（5-2），其质量由于透明带呈椭圆形并粘附中性粒细胞而从1级降为2级；另一个黄色箭头所指那个胚胎为2级桑葚胚（4-2）；图中还能发现有几个卵细胞/胚胎正被中性粒细胞吞噬。
1.请同道们仔细参阅以下各图，自测如何评估OPU/IVF胚胎质量优劣？
图3.示各分图中的胚胎质量分级正确答案。左上分图（40xBF）：红色箭头所示均为1级扩张囊胚（7-1）；绿色箭头所示均为1级囊胚（6-1）；黄色箭头所示均为1级早期囊胚（5-1）；蓝色箭头所示均为1级桑葚胚（4-1）；橙色虚线箭头所示均为分裂的未受精卵细胞。中上分图（40xBF）：该图所示许多胚胎均为1级扩张囊胚（7-1）；但红色箭头所示均为透明带破裂胚胎；如果对其它胚胎仔细地滚动检视，还可发现更多透明带破裂胚胎，许多这些未能发现透明带破裂胚胎往往会被误定级为1级胚胎，但任何胚胎透明带只要发生破裂就需将其质量等级从1级降至2级。右上分图（100xDIC）：该图所示许多胚胎均为1级桑葚胚（4-1）；右上角是一个1级早期囊胚（5-1）；黄色箭头所指均为早期囊胚，而黄色箭头顶尖所示位点则是早期正在形成的囊胚腔。左下分图（100xBF）：1号为退化受精卵细胞；2号为2级桑葚胚（4-2），该胚胎在12点钟至5点钟区域可看到几个挤出卵裂球；3号和4号均为退化受精卵细胞，其没有像2号胚胎那样出现融合卵裂球，3号内部似乎存在一些融合活细胞，但仔细检视这并不太可能。中下分图（100xDIC）：除了黄色箭头所指的那个1级囊胚（6-1）外，其它均为未受精卵细胞。右下分图（100xDIC）：除一个3级桑葚胚（4-3）外，其它的要么是未受精卵细胞（UFO），要么是退化胚胎（Degen）。
图4.上分图三个胚胎质量分级的正确答案是（100xDIC）：左侧为1级早期囊胚；右侧为1级桑葚胚（4-1）；中间为2级桑葚胚（4-2），降级理由系在该胚胎7点钟位点出现裂纹。下分图40个胚胎质量分级的正确答案是（40xBF）：1号为1级囊胚（6-1）；2 号和 3号均为1级扩张囊胚（7-1）；4号为1级囊胚（6-1），该胚胎囊胚腔看起来比内细胞团要小，但进行滚动检视可发现囊胚腔实际比内细胞团要大；5号为1级扩张囊胚（7-1），注意该胚胎直径较大，加之胚体持续生长发育膨胀而使透明带变薄；6号为1级扩张囊胚或囊胚（7-1或6-1）；7号为1级囊胚或早期囊胚（6-1或5-1）；8号为1级扩张囊胚（7-1）；9号和10号均为1级早期囊胚（5-1）；11号和12号均为1级扩张囊胚（7-1）；13号为1级早期囊胚或囊胚（5-1或6-1）；14号为2级或1级桑葚胚（4-2或4-1）；15号为1级早期囊胚（5-1）；16 号为1级扩张囊胚（7-1）；17号为3级桑葚胚（4-3），该胚胎卵黄膜难以清楚界定，在12点钟至6点钟区域卵黄膜呈现 “磨损” 外观，主要细胞团中可能存在一些活的融合细胞，但许多外周细胞已退化。18号为2级桑葚胚（4-2），在该胚胎6点钟、7点钟和12点钟位点分别出现死亡卵裂球。19号为1级早期囊胚或囊胚（5-1或6-1）；20号为1级囊胚（6-1）；21号为1级扩张囊胚或囊胚（7-1或6-1）；22号为1级早期囊胚（5-1）；23号、24号和25号均为1级桑葚胚（4-1）；26号为2级桑葚胚（4-2），降级原因是胚体形状异常；27号为2级桑葚胚或早期囊胚（4-2或5-2），降级原因是在该胚胎3点钟位点出现透明带裂纹；28号为1级扩张囊胚（7-1）；29号为1级囊胚（6-1），尽管该胚胎略呈椭圆形，但并无其它瑕疵，所以依然可判定为1级；30号为1级扩张囊胚（7-1）；31号为1级囊胚（6-1）；32号为1级扩张囊胚（7-1）；33号为1级囊胚（6-1）；34号为1级桑葚胚（4-1）；35号为1级扩张囊胚（7-1）；36号为1级扩张囊胚或囊胚（7-1或6-1）；37号为2级桑葚胚（4-2），该胚胎也可评估为2级扩张囊胚（7-2），原因在于该胚胎可能缘于冲卵回收流程压力过高而致囊胚腔塌陷，所以会误判为桑葚胚，当然该胚胎透明带直径明显大于34号胚胎，这也可视为评估为扩张囊胚的证据之一，降级理由是在该胚胎7点钟位点出现透明带裂纹；38号为1级扩张囊胚（7-1）；39号为1级早期囊胚（5-1）；40号为1级囊胚（6-1）。
2.图5为国内某公司提供的OPU结果，请同道们评估其OPU技术流程是否靠谱？为什么？
图5.国内某公司提供的OPU结果，其OPU技术流程是否靠谱？为什么？
3.图6为国内某公司提供的IVF结果，请同道们评估其IVF技术流程是否靠谱？为什么？
图6.国内某公司提供的IVF结果，其IVF技术流程是否靠谱？为什么？
4.图7为国内某公司提供的商业化OPU/IVF生产的胚胎质量评估结果，请同道们审核其评估结论是否准确？为什么？
图7. 国内某公司提供的商业化OPU/IVF生产的胚胎质量评估结果，其评估结论是否准确？为什么？
三、国产商业化OPU/IVF生产的牛胚胎需要提供哪些证书和如何标示？
国产商业化OPU/IVF生产的牛胚胎实际属于一种牛遗传物质商品，理应给终端客户（牛育种者）提供足够和可靠的商品信息。国际社会对拟进行市场流通交易的这类牛胚胎应该提供哪些证书和如何正确标识有着严格规定和通用标准要求，如同我们经常使用的进口冻精那样。国际社会的那套证书和标识系统及通用标准要求非常复杂和具体，鉴于我国当前国产商业化OPU/IVF生产牛胚胎刚刚起步，规模不大，并且一般仅限于就地使用，所以至少眼下不必全盘照搬，但可参考其要点而适当简化，表1和图8即是这样的两个模本。
表1.国产商业化OPU/IVF生产的牛胚胎需要提供哪些证书？
图8. 国产商业化OPU/IVF生产的牛胚胎如何标示？（HO=荷斯坦品种）
四、我国目前商业化OPU/IVF生产胚胎技术自主研发和推广普及的阶段性进展与成果究竟如何？
经不足两年不懈努力和艰辛摸索，我国目前商业化OPU/IVF生产胚胎技术自主研发和推广普及取得了鼓舞人心的阶段性进展与成果，简括于表2和表3。不过，由于这些数据依然偏少，同时国内商业化OPU/IVF生产胚胎对妊娠后流产率、分娩畸犊率和巨犊率的影响因移植受体刚刚妊娠而暂时无法获取，故为慎重起见，起码现时尚不能给出任何定论。
表2.我国目前商业化OPU/IVF生产胚胎技术自主研发和推广普及的阶段性进展与成果究竟如何？
卵母细胞 平均数量 | 卵裂率 | 囊胚率 | 冻胚 移植 | 鲜胚 移植 | 冻胚移植 受胎率 | 鲜胚移植 受胎率 | 备注 |
13.5 | 75% | 45% | 135 | 0 | 65% | 0 |
表3.培训合格骨干OPU/IVF技术人员所需资历、基本技术、培训时间和动物性耗材有哪些要求？
骨干技术人员类别 | 学历 | 基本技术 | 培训时间 | 动物性耗材 |
OPU技术主管 | 畜牧兽医专业本科以上 | 人工授精 B超诊断 | 3个月 | 400头次左右 |
IVF实验室主任 | 关联专业本科以上 | 生物实验室 | 12个月 | 10000-15000枚卵母细胞 |
结束本文之前，需要向各位同道由衷致歉和解释：因自己缺乏IVF实践经验，所以并未阐述OPU/IVF全套技术中这一核心环节，相信日后定会有这方面专家与大家共享其经验。
▍本文来源：荷斯坦杂志
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