体外胚胎移植技术可以为牧场提供顶级遗传物质、助力牧场单产跨越，也是在育种领域广泛应用的一项技术。
目前国内也有不少牧场和大牧业集团在体外胚胎移植领域进行尝试，但国内从业者技术水平、供体牛体况等方面仍有很多挑战，目前处于摸索阶段。
9月14日威斯康辛洲农业厅联合威斯康辛知名企业打造的“中美体外胚胎技术应用 市场前景与挑战”主题直播，美国Gen Ovations和TKE公司代表就胚胎一直技术关键点以及市场潜力做了分享，供从业者交流探讨~~
Nate Dorshorst Gen Ovations Inc
首先，胚胎移植能够让供体在短时间内产出更多的后裔，从而加速遗传进展。其次是生物安全。胚胎被包裹在一个叫做玻璃袋的相对坚固的球体内，有着完整的玻璃袋保护，外面附着的潜在病菌和病毒可以用胰蛋白酶降解和洗涤，去除潜在的病菌，这样才使得胚胎交易在全球成功，用户可以放心使用进口胚胎，不用担心外来病菌。再一个优势是获得性免疫功能。胚胎在发育过程中会被动接受代孕母牛的免疫功能，增加抵抗力，较快地适应当地病原菌压力。而在活体牛进口时，会看到较高发病率，甚至死亡率。被动免疫使得胚胎移植的小牛落地时就有抵抗新环境的病菌能力了。
无创伤收集体内胚
供体母牛先要进行激素处理，在一天排出多于一个的卵子。通常会用促卵泡生长激素（FSH），注射几次达到超排目的。配种7天后冲胚，用Foley导管把冲胚液灌进和吸出，把吸出的冲胚液过滤，收集胚胎。技术员要知道如何去区别活胚、退化胚和死胚。
冷冻保存
我们可以把胚胎冻存起来，以后再移植。用程控仪控制降温速度。液氮冻存胚胎是个方便、廉价的办法，可以把胚胎无限期地冻存。冻存的胚胎，坐胎率不会下降。同活体进口牛相比，冷冻胚胎具有优势，1500美元就可以把500枚胚胎送到世界的任何一个角落。
体外受精导论
下面可以看到我们用的工具。真空装置带有恒温控制，维持采集瓶的温度，这样能保证卵子在适当的温度。采集枪上带有塑料套，防止交叉感染。一手抓采集枪送进阴道，另一手进直肠控制卵巢。观察B超显示屏来移动针头穿过阴道，进入卵巢。
活体取卵要比体内冲胚难得多，特别要注意时间、温度和牛固定。真空流量大概每分钟20～25毫升。样本温度保持在37.5℃，房间温度大于27℃。卵丘卵子复合体对温度非常敏感。牛要固定好，因为针要穿透阴道壁和其他重要器官。样本不要在卵巢外和培养基以外待得太久。
首先给固定好的牛尾椎柱打麻药，清除直肠中的粪便，擦干净外阴，一手把采卵枪放进阴道，另外一只手在直肠中把卵巢从输卵漏斗和韧带拨开抓好。用B超指导，穿刺大于4毫米的卵泡，吸取卵子。
另外，要注意避免感染。我们通常会做阴道灌洗，保证阴道的干净。在牛和牛之间，采集枪要用酒精擦洗，并换上新鲜干净的无菌枪套。要注意不要穿刺黄体，特别是怀孕牛的黄体；避免流产和卵丘卵子复合体消解，减少出血性或囊肿的卵泡，一旦凝血，前面采集到的卵泡也就废了；不要多次穿刺同一卵泡，更不要穿刺卵巢基质，破坏将来的生殖细胞；不要穿刺到子宫中动脉；不要刺破卵巢蒂和卵巢供血动脉。
卵细胞分级
从照片可以看到卵子被多层密集的卵丘细胞包裹着，几乎看不到卵子。大于3层的卵丘细胞的卵子为一级；2～3层卵丘细胞为二级；1～2层卵丘细胞为三级。只有几个卵丘细胞或裸卵为四级。退化、膨大又不能确定发育阶段的卵子要放弃。另外，也要看卵子的细胞质是否均匀；变色、染色质结团的卵子不能用。好的卵子会有好结果，差的卵子很少有好结果。这两张图片比较差和好的卵子。上图左边是退化、膨大的卵子，卵丘松散；右边是优质卵子，卵丘紧密，多层。
我们要收集高质量的卵丘细胞层的卵子。尽管前面提到卵子原生质均匀度也是卵子分级的一部分考量，但是卵丘的质量和数量才是决定卵子级别的最重要指标。供体种类、供体健康和营养、超排激素处理方案、活体采卵技术、样本处理都会影响卵丘质量。卵丘与卵子的成熟、受精以及后来的胚胎发育高度关联。卵丘和卵子的亲密结合影响卵子存活、健康和发育。近来有多个关于卵丘细胞在体外受精作用的研究。上图中，可以看到卵丘通过玻璃袋突出，直接伸到卵子细胞质中。这些突出中的间隙，如同高速公路，卵丘细胞把培养基中的营养物质送进卵子。只有高质量的卵丘，才会有健康的卵子发育成胚胎。
我们先从供体母牛活体取卵得到的优质卵子在实验室培养和受精，总共8天左右，我们期望得到一群发育良好的桑葚胚。这些胚可以立即用于鲜胚移植，或冻存起来，将来移植。
受胎率
高质量的受体母牛加上一个移植老手，新鲜体外胚的平均受胎率可达45%～55%。冻存的体外胚的受胎率会低一些，平均在40%～50%。当然，这是老手和优良受体的条件下。
Gen Ovations 公司12年的经验
我们公司做了12年的胚胎生产和移植。这12年里我们学到了什么呢？我们做了对培养液和培养系统不断的改进来争取最好的结果。我们发现每头供体母牛需要不同的超排处理方案，不能一刀切。我们把实验室向其他胚胎生产产家开放后，他们送来的卵子带来了更多的变数；在故障排除中，我们积累了不少经验。我们必需要注意细节、细节、细节，上百个细节，每个细节都会有微妙的提高。
产犊成功受三大因素影响：胚胎质量、受体质量和技术员的经验。通常会在预产日接生健康和正常体重的小犊牛，但也有大约10%的超过预产期。我们必需强调在预产日诱导分娩，不然会因为小犊牛过大而造成犊牛和母牛死亡。
绣牛，也就是展览比赛牛不好取卵；小于8～10个月的后备牛也不好取卵；太年轻的公牛精液体外受精效果差；高强度泌乳牛的效果也差——泌乳和繁殖两功能总是打架。另外，夏天高温和其他应激的环境条件也会产生困难。
首选的牛
泌乳大于60天的牛，11个月以上的青年母牛。我们特别喜欢用怀孕母牛，怀孕了本身说明这头牛的生殖功能好。对于生产困难牛，我们先让其怀孕成功后再活体取卵，往往会得到更好的结果。另外，我们要做激素诱导。
诱导相比不诱导
美国胚胎移植协会2019年122431次活体采卵的数据表明：采用激素诱导的平均产6.2个胚，非诱导的只有2.5个胚，这是一个巨大的差别。所以，我们会采用激素诱导。当然，诱导会增加成本和劳力，也会让母牛产生应激。诱导包括4～7针固定或逐步减低的激素量，打完激素后会有18～48小时的静止期后再采卵，这个时间因品种和个体而异。
除去优势卵泡法
我们要建立超数排卵波，可以通过化学激素法或者物理法清除优势卵泡。我们可以用采卵针挤破优势卵泡来取得排卵波，使用GnRH性腺释放激素也是为了这个目的。但是化学方法不一定有效，物理方法有保障。6149个体内胚生产数据表明，物理法平均可以达到8.3个有效胚，D8-14 GnRH仅平均处理6.3个有效胚，这样物理法比化学法提高了32%的效率。所以，我们积极倡导物理除去优势卵泡法。
其他重要考量
其他重要的考量包括所用的各个培养液，紫外光暴露，事实上卵子胚胎无需见光。体外受精实验室的空气质量尤其重要。温度、时间长短、酸碱度变化的影响。可能被忽略的是塑料器皿，如培养皿、离心管、导液管、细管等等，它们是哪个厂家生产的，有无残留毒物都要注意。
受体
影响体外胚胎移植成功三因素之二是受体。一旦胚胎离开了实验室，受体母牛的质量是其中最关键的要素。受体母牛群的人工输精成功率是牛群繁殖功能的判定依据。我们喜欢用青年后备牛，或者头胎产奶超过70天的成年奶牛做受体。初次发情和第二次发情的青年母牛也是好受体母牛，发情两次后的母牛只用于正常人工输精配种，而不作为受体。自然发情和激素调整的同期发情母牛哪个作为受体更好？我们发现两种方法都挺成功。体外胚的移植更需要注意每个步骤的时间节点。我们喜欢在发情后第7或者8天才移植体外胚。我们要清楚母牛的免疫程序，特别用的是改性活疫苗，打疫苗至少45天以后再移植。最后，尽可能在胚胎移植的前后各一天不移动受体母牛。
何时转运受体牛？
我常常被问及什么时候可以转运受体母牛？很明显，一头母牛刚入群时都会因为被欺生而发生应激反应。从发情算起，胚胎移植在第7或8天进行，母牛在第15～17天感知怀孕，胚胎在第19天贴子宫壁，第21～22天在子宫着床。如果你必须要转运母牛，就早比就晚要好。通常的建议是移植后24小时内转运，或者怀孕60天后进行。
技术员的影响
影响体外胚胎移植成功三因素之三是移植技术员，他们对最后的成就影响巨大。技术员动作要快并且柔和。深部移植是要把胚胎放到子宫角最深的位子。如果把子宫角分为三部分，最深的1/3部位是靠近输卵管的那一段。需要注意，如果手脚慢又不柔和，那就不要强调深度了，把子宫角弄伤了，其他也就没意义了。
总体来说，体外胚的优势有以下几点：首选，它是当前商业可及的最快推进遗传进展的工具。基因编辑可能更快改变基因组合，但还不能商业化使用。同体内冲胚相比，我们可以每两周，甚至每一周取卵。而传统冲胚，至少要间隔30天。其次，活体采卵针不经过子宫。所以，我们也可以在怀孕牛身上做活体采卵。而传统冲胚要经过子宫，怀孕的牛做不了。第三，我们可以在性成熟前的小牛做活体采卵。第四，尽管做的不多，但是还有在10%的不孕牛也做活体采卵，这些牛因为输卵管堵塞、子宫粘连而不能进行传统冲胚。第五，我们还可以在淘汰牛，受伤的牛身上取卵。第六，前面提及超排处理，在传统冲胚是必须的，但没有结束FSH时，我们也可以做活体采卵。第七，我们可以把稀有和贵重的精液分配到多个牛的卵子中去，比如6～12份。第八，一头母牛每年产更多小犊牛，体外胚法一个母牛可能每年提供50个小犊，体内胚法最多35个小犊。最后，可以达到多种配种组合。
遗传进展无疑是个数字和速度的游戏。减速分裂导致独立的基因重组，因此出现特异的个体。体外受精能在短时间内产出更多的个体。
上面是遗传进展公式，其中有两个变量。首先是变量-选择强度（selection intensity， si），它是分子，数字愈大，遗传进展就更快。体外受精提供更多的个体供选择，相配多个公牛提供差异；从多个变异，选择极少几个，这就是增强选择强度。第二个变量是世代间隔（generation interval，gi)。它是分母，值越小，遗传进展就更快。所以我们用年轻母牛和青年公牛来做体外受精。我们需要对这些年轻牛评估才能相信最终结果，这样全基因组评估就特别重要。我们要相信全基因组方法。
体外胚劣势
体外受精也有不足之处，比如活体采卵技术难度高，采卵要在温度更稳定的环境中进行，要有牛保定装置。另外，体外胚比较脆弱，细胞数量少，更难冻，解冻后受胎率低下。此外，从农场到实验室再到农场涉及不少人员，交通费用增高，通信费用增多。因此，单个体外胚移植坐胎费用比较高。
我们的胚胎产业正在接受新的前沿技术，比如激光辅助孵化，在玻璃袋上用激光刺孔帮助孵化；活体取样检测：性别、隐性基因，基因组；胚胎分割后移植，一胚两胎；用胚胎细胞克隆等等。
另外，更多前沿技术的利用，比如电脑辅助精液评估，去除优势卵泡，各类内分泌学调控手段，下属卵泡透出和卵泡波测画等等。还有母牛性成熟前调控，如激素暴露、营养调节让她们一旦进入供体群体，就能取得优秀结果。
可持续发展喂养世界
我们要做的是可持续发展和喂养世界，即高效的可持续生产蛋白原，没有比用动物蛋白更好的方式来喂养人类了。利用基因组和先进的繁殖技术，我们是如此有效地生产动物蛋白。据预测，2050年世界上将有97亿人口。那么我们就需要更健康高产的奶牛，并且少用水、电和饲料，使得蛋白生产更有效。过去70年美国的进步，产生的牛奶成百倍提升，我们反而少用了21%的牛、23%的饲料、35%的水、10%的土地，少排放了24%的粪和37%的碳。这就是提升牛的繁殖技术和遗传进展的终极目标：可持续发展用动物蛋白喂养人类。
Gerardo Quaassdorff
美国家畜出口商协会副总裁
今天主要给大家分享一下美国奶牛的体外受精胚胎情况，以及中国的奶牛养殖可以从中获得哪些好处。
美国的奶牛中包括成母牛和小母牛80%以上没有在育种协会登记。换句话说，大部分美国牧场的主要收入来源是贩卖牛奶，所以他们的奶牛一定会要求比较高的遗传价值，这样牧场才能够盈利，而且产品才能够满足消费者的高标准和严要求。
美国的母牛数量是全球最多的，也是多样性最强的，因此现在国外卖的大部分胚胎和精液都是来自于美国。大家在美国可以选择各种各样的牛，不管是什么体格、蛋白高还是低，可以是活牛也可以是胚胎，应有尽有。美国的牧场自己能组织的非常好，而且可以提前做好规划，这样能让我们的投资带来最大的收益。
美国的牧场会使用很多软件工具来帮助大家购买以及识别最好的牛种和最好的遗传性状等相关信息。评估由美国奶牛育种委员会来做，而这个委员会提供的信息又可以让牧场使用相关的技术比如说IVF体外受精胚胎、性控精液，还有其他的一些技术，这样可以增强美国整体奶业的盈利率。
如何做到这一点？有一种技术叫基因组检测。基因组检测可以让牧场很好的选择高遗传价值的动物，其主要就是看这些动物的DNA构成。基因组检测的出现让牧场有更多的机会更好的去选择想要的奶牛种类。也是因为这个原因，现在中国也可以用到美国最好的牛种、最好的公牛以及IVF体外受精的胚胎。美国每个月有大概5万头犊牛会进行基因组检测。
美国的奶牛可以进行出口，有的是通过活牛出口，有的是通过胚胎出口。如何选择相应的奶牛进行养殖？美国主要参考两个指标：一个是增值量，一个是GDPI值。增值量是由美国农业部开发的，GDPI值则是由美国育种协会荷斯坦协会开发的。牧场会在自己的牛种里找到相应的牛，根据这两个指标判断牛的价值有多高，然后再进行IVF的项目。
遗传价值最高的小母牛，他们一般会选择性控精液进行人工受精，然后产生小母牛，这样可以尽可能增加后备小母牛，扩大运行的规模；而遗传价值第二高的小母牛一般用于IVF胚胎的受体，这种类型的小母牛在牧场一般品质处于中等，而且它们一般是用于顶级供体奶牛的胚胎受体，这种类型的小母牛一般也会进行人工受精，用的是更高品质的肉牛精液，因为在牧场养殖中使用肉牛精液可以提高小母牛的市场价值；遗传价值最低的那些小母牛，一般情况下作为犊牛的时候就已去世，或者改成肉牛养殖，又或者作为IVF胚胎的受体存在。
从出口的角度和实际的角度来看，IVF体外受精胚胎可以让你制定长期的牧场发展目标，并且不断增强扩大牛群。有了这个技术后，世代间隔缩短，这样你就能打入高端市场。这一点当今非常重要，因为现在的消费者市场在不断的变化，有了这个技术后就可以更快的去改变牧场里面的牛群，更好的满足目前高端市场的需求。
从牧场的管理角度来看，你也可以针对性的做一些遗传性状的改进。比如现在要在两个不同类型品种的高遗传质量的动物之间进行杂交更容易也更快，如我们可以把高质量的娟姗公牛和高质量的荷斯坦母牛来进行杂交，产生的后裔可以更好的满足高端市场如奶酪市场或者其他类似高端市场的需求。
IVF体外受精胚胎也有一些和它形成竞争的技术，主要就是性控精液的使用。精英公奶牛产生的性控精液可以大规模的购买，在使用时适合大型的商业牧场，这样可以产生大量的母牛，而且成本非常低。IVF一般情况下使用时，要求牧场的技术成熟度比较高，而且使用规模小。
如果大家想出口胚胎或者在中国想要从国外进口胚胎，需要做到哪些呢？中国和其他很多的国家一样，都有一些特别的规定。对于美国，中国有一些特殊的规定，比如说只有经过审批的胚胎机构才能够提供胚胎和IVF胚胎，只有经过审批的种牛或者是胚胎可以用于进口或提供相应的精液和IVF胚胎。
美国农业部和美国农业部下属的动植物卫生检验局和中国的对口单位一起商定了一些检测的要求和法律监管。胚胎的检测要求也会随时变化，所以大家在牧场如果要出口胚胎或者想从美国进口胚胎，就一定要在开始制作胚胎之前了解相应的法律规定。IVF胚胎和体外胚胎的规定可能是不一样的，我们一定要遵守相应的规定。
基因组的检测让全球的客户可以选择更高质量的IVF胚胎，可以从那些更高质量的供体动物中获得这些胚胎。而IVF胚胎也可以让我们制定更长期的牧场运营的目标，因为它可以帮助我们更快的满足市场的需求。
IVF技术目前也面临一些竞争性的技术，比如像进口的性控精液以及进口乳用小母牛目前是能够替代IVF最好的方案，这样可以让大家通过低成本来增加自己的后备小母牛。美国威斯康辛州现在有非常高质量的奶牛，可以供大家去选择活牛精液或者胚胎。
（本期内容根据荷斯坦大讲堂“中美体外胚胎技术应用、市场前景与挑战”发言内容整理）
来源 | 荷斯坦杂志
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