【能力验证操作】食品中菌落总数检测的能力验证操作过程分享

食品微生物检测

菌落总数小常识

菌落总数的测定方法，看似非常简单，但由于食品种类繁多，食品中可能存在的微生物菌群较多，要在同等条件下把所有的细菌培养出来，反应样品的真实情况，实属不易。

一、能力实验的目的

开展能力验证试验是检验实验室检测能力和提高检测水平的重要手段。利用实验室间的比对，对实验室的校准或检验工作进行判定。

关键是，能力验证是考察实验室检验能力的外部质量活动，组织方提供试验样本，在菌落总数项目上，一般会考虑增加上述难度。

二、测定标准

食品国家标准：GB 4789.2-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

三、操作过程

（一）、前期做好充足的准备工作：

根据国家标准，提前准备好要用的平板计数琼脂、平皿、试管、稀释液（生理盐水）、三角烧瓶等。

（二）、样品接受：

收到样品后，确认样品包装是否完好，并将其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力验证平台进行确认。

（三）、样品处理：

按照作业指导书操作（一定要仔细阅读作业指导书）看看是几个样品及实验记录要求。一般实验室收到的是干粉样品或者是固体样品等。假如收到的是干粉样品，那么第一步就要水化。

样品水化步骤（建议）：一般能力验证样品以国体粉末形式发放，以液体（CFU/mL）形式出报告。样品水化前一定要认真、仔细阅读作业指导书，看看用多少稀释液水化，水化后作为原液还是多大浓度的样品来记录。

（四）、实验前准备：

a、能力验证时最好在超洁净台或者生物安全柜里操作，这样就要把超洁净台或者生物安全柜提前清理、消毒处理，确保实验环境无菌。

b、提前把要用到的平皿、试管、稀释液等放到操作台上。

（五）、实验操作：

a、稀释

将样品从冰箱中取出达到室温后开启使用，在超洁净台或者生物安全柜下先用少许稀释液（选取的生理盐水）进行水化后吸入无菌瓶或袋中，再用剩余的稀释液进行洗涤并全部转入无菌瓶或袋中。（具体公需多少稀释液要看作业指导书说明）

洗涤转移时注意样品瓶盖的清洗和无菌操作，将全部的水化液进行均质混匀，一般作为原液立刻进行接种；再取25ml到225ml稀释液中均质混匀，制成10-1梯度样品匀液。

用1ml无菌吸管取1:10的样液到9ml生理盐水试管中，制成1:100的样液，以此类推。再将几个稀释度的样液接种到提前做好标记的无菌平皿中。

b、倾注平板

将提前在水浴锅里凉至46℃的平板计数营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。倾注过程一般左手拿平皿，右手拿琼脂瓶，左手将平皿打开30度左右的缝隙，倾注琼脂大约到平皿底的二分之一处，左三圈、右三圈轻轻混匀，然后放到台面上。

待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。

e、观察计数

最好，第二天先看看，检测结果有没有异常、是否有蔓延菌落出现。

按照GB 4789.2的要求进行菌落计数

f、上报数据

在对结果进行分析后，选取检测结果的平均值进行网络提交。

注意事项：

a.一般能力验证的样品添加的菌落浓度都比较高，检测过程一定要多做几个稀释度，每个稀释度多做几个平板平行。

b.梯度稀释：是关键步骤，必须尽可能地减少误差（新手建议涡旋混匀，涡旋时间不宜过长，长时间离心力等作用下，微生物细胞可能死亡）。

c、倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。

d、倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。

e、倾注过程力度一定掌握好，绝不能把琼脂溅出来。

f、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿时要尽可能放在中央部位，然后应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。

g、琼脂瓶放水浴锅前一定要混合均匀，以防出现平皿不凝固现象；拿出倾注时要用喷有75%酒精的抹布擦拭干净。

h、冷却的过程不要着急，冷却充分后再倒置放进培养箱培养，放置的时候要尽量避免放到风机口处，每摞不要超过6个平皿。

i、检验结束后所有的稀释液样品一定要放到冰箱里0-5℃冷藏，以备必须再用（一旦第二天发现实验做错了，在做一次实验，死马当活马医）。