脑细胞外谷氨酸的积累可以导致神经元凋亡。本研究的目的为了调查影响细胞外谷氨酸积累的原因和干预机制，从神经外科重症监护室的动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）患者中的脑微透析样品收集中发现细胞外谷氨酸和一氧化氮（NO）代谢物的水平升高与SAH患者的不良临床结果相关，后续体外实验显示，在大鼠原代离体神经元培养和细胞系中，酮戊二酸脱氢酶复合物（OGDHC）作为三羧酸循环（TCA）中谷氨酸依赖的关键酶，容易受到NO的抑制。NO或OGDHC的特异性抑制剂SP，可引起细胞外谷氨酸的积累和神经元的凋亡，OGDHC的辅助因子硫胺素（TH）重新减少细胞外谷氨酸水平。本研究表明机体对细胞外谷氨酸控制的丧失不是通常认为的能量代谢受损而是OGDHC活性不足的病理表现。文章发表于2023年的《Redox Biology》。
https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102669
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研究背景
线粒体功能紊乱、神经炎症和谷氨酸毒性与脑损伤和神经退行性疾病有关。其中，线粒体功能障碍与神经炎症来源的一氧化氮（NO）生成增加有关。大脑中一氧化氮的主要来源是免疫细胞被伴随着急性脑损伤和神经退行性疾病的神经炎症而被激活。
NO在线粒体内有多个目标，包括三羧酸（TCA）循环的酶、电子传输链（ETC）的复合物和线粒体通透性转换孔（mPTP）。但这些实验中采用的NO浓度很高，超出生物学浓度范围。在直接测量急性脑损伤后大鼠脑组织中NO，其浓度低至4μmol/kg（4nmol/g）。在临床环境中，只能对NO进行间接检测。在急性脑损伤患者中头7天的NO代谢物总量（亚硝酸盐和硝酸盐）可以通过对大脑受影响部位的微透析来确定，发现NO的水平约为100μM。在脑损伤的急性期结束后，NO的水平会下降到40μM以下，但这些浓度仍然大大高于血中的浓度，大约为15μM。
研究表明，氮氧化物水平的升高与细胞外谷氨酸水平的增加有关。这与谷氨酸受体的激活有关，并导致兴奋性毒性和神经元凋亡。谷氨酸的生理和兴奋毒性作用是由两组不同的谷氨酸受体介导，分别是突触和突触外的谷氨酸受体。下降谷氨酸的细胞毒性效应可以通过降低其细胞外浓度，使其进入星形胶质细胞和神经元实现。主要的谷氨酸转运体-1（GLT-1），在星形胶质细胞中高度表达，但也在神经元中表达。在神经元中GLT-1介导的谷氨酸的摄取主要是为能量代谢提供谷氨酸，神经传导则由谷氨酰胺/谷氨酸循环支持。而在星形胶质细胞中，GLT-1介导的谷氨酸的吸收调节着细胞外谷氨酸的持久性和神经元中NMDA受体激活的持续时间。重要的是，星形胶质细胞中的GLT-1会自发地从突触中释放谷氨酸，兴奋性毒性作用也会加重。
本文前期研究已经表明，在急性创伤性脑损伤的动物模型和蛛网膜下腔出血（SAH）的急性期患者中，NO代谢物的增加。由于谷氨酸的代谢与线粒体功能有关，而线粒体功能又受到NO的调节。因此我们假设NO能够抑制酮戊二酸脱氢酶复合物（OGDHC），从而限制谷氨酸的消耗。因为在TCA循环中，OGDHC促进了酮戊二酸的周转，而酮戊二酸是由谷氨酸脱氢酶来源产生的。因此，NO可以导致导致谷氨酸积累在细胞外空间，使神经元细胞死亡。为了阐明这一机制，本文在动物模型和SAH患者中研究了NO与细胞外谷氨酸的关系。使用细胞培养模型，研究了细胞对谷氨酸的摄取进入线粒体和OGDHC介导的谷氨酸消耗的活性。
本文研究还发现琥珀酰膦酸酯（SP）是一种高度选择性的OGDHC抑制剂，可以抑制该复合物的第一个组成部分的同工酶。在神经元培养中，使用OGDHC辅酶硫胺素（TH）和抑制剂SP对OGDHC的参与进行了剖析。证明了TH具有能够恢复被NO干扰的OGDHC的功能，使谷氨酸水平正常化并防止细胞死亡，而SP则引起细胞外谷氨酸的积累和神经元的死亡。TH作为积极效应的分子，这在早期的神经创伤大鼠模型中已经观察到。本文建议TH可被用于实验性治疗的一种策略，以改善谷氨酸的兴奋性。
02
研究方法
该研究的患者为回顾性收集于一个前瞻性研究的数据库，包括2016年至2020年在神经外科重症监护室患有动脉瘤性SAH，在出血后第3天之前植入脑部微透析探针的患者，将其插入额叶白质。以0.3μL/分钟的流速灌注导管。微透析采样开始于在探针植入后3小时内开始，是每小时在微孔中收集一次，立即在床边进行分析谷氨酸的浓度。为了确定早期脑损伤期间的脑谷氨酸水平、每位患者在出血后第3天的谷氨酸浓度平均后取均数。出血后3个月，使用改良的Rankin量表评估了功能结果。本研究了20名患有严重动脉瘤性SAH的病人。
从雄性Sprague Dawley大鼠，大脑皮层制备大脑皮层匀浆，这些匀浆液用于估计线粒体呼吸、复合物的活性和NO释放。线粒体呼吸采用高分辨率呼吸测定法，NO-Hb、NO-Fe复合物测定采用电子顺磁共振光谱法（EPR）。大鼠神经母细胞瘤细胞（B35细胞）、小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞（NG108-15）细胞妊娠第14天原代离体间脑神经元培养物进行体外培养,收集培养上清液以检测细胞外谷氨酸浓度和LDH。使用Vectastain ABC过氧化物酶试剂盒对细胞进行染色。抗酪氨酸羟化酶染色后，测量神经元长度。
OGDHC的活性是通过监测NAD+的还原来确定的。谷氨酸脱氢酶（GDH）的活性是在340纳米处通过监测NADH的减少而测量的。为了确定培养物上清液和新鲜培养基中的谷氨酸水平，一种基于检测3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）的还原形式的方法，即这种NAD+的类似物，可作为谷氨酸被GDH氧化的产物被检测。丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）的活性是通过检测由NAD+催化的NADH形成来确定的。为了测量细胞内自由Ca2+浓度的变化([Ca2+]i)，皮层神经元被装入低亲和力的Ca2+指示剂Fura-FF/AM，为了同时测量[Ca2+]i和ΔΨm，细胞也被加载rhodamine123。
02
研究结果
图1 大脑NO、谷氨酸水平与SAH患者的临床结局相关 a.动脉瘤SAH患者的示意图，导致早期脑损伤、导致微循环低灌注和延迟性脑缺血 b. 入院后21天内发生的脑梗塞患者比例 c. 3月后mRS评分预后不佳患者比例 d. 代表两名患有严重动脉瘤性SAH的患者，均为Hunt&Hess IV级，显示出不同的临床过程。在病例患者1（d）中，脑微透析（MD）显示谷氨酸水平在早期脑损伤后为1.4μmol/L。在这名患者中，CT上没有继发缺血事件，3个月时显示出良好的恢复。2号患者（d）的脑部谷氨酸在第3天高达58.5μmol/L。该患者在接下来的几天里发生了多处脑梗塞，导致功能状况不佳。e.SAH后第3天的大脑谷氨酸水平与继发性缺血之间的相关性. f.SAH后第3天的大脑谷氨酸水平与功能预后之间的相关性
图2 NO对大鼠皮层匀浆中TCA循环酶和线粒体呼吸的影响 a. TCA循环中谷氨酸依赖的部分的示意图 b.c. NO对谷氨酸脱氢酶（GDH）和酮戊二酸脱氢酶复合体（OGDHC）活动的影响,显示GDH的活性不受影响，而OGDHC的活性却被4μM NO抑制 d. 亚硝酸盐对OGDHC活性的没有影响 e. e-inset通过标准的极谱法测定的线粒体氧化磷酸化功能(OXPHOS)的实验程序，f.g. NO对是通过复合物I（f）和复合物II（g）来影响线粒体氧化磷酸化（OXPHOS)，但NO所需的浓度远远高于OGDHC所需，无论通过复合物I底物谷氨酸测定（复合物I）和还是通过琥珀酸（一种复合物II的底物）测定。h.I. 与NO相反，5μM的过氧亚硝酸盐（ONOO-），一种NO和O2的反应产物，可以抑制复合体I(h)和复合体II（i）。因此，低浓度NO只能抑制OGDHC，如上所述。这将阻止线粒体对谷氨酸的消耗，促进其在细胞质中的积累，然后是自发的谷氨酸释放到细胞外，诱发细胞死亡。
图3 红细胞RBC对OGDHC活性的影响。a. 在有RBC的情况下，脑组织中NO的生成途径主要来源是NO合成酶家族，主要的NO代谢物为亚硝酸盐。但它可以通过亚硝酸盐还原酶还原成NO。b. 由于SAH患者中亚硝酸盐水平和出血水平高，红血球中的亚硝酸盐会释放出额外的的NO，进一步加重OGDHC的功能障碍。为了验证这一假设，使用本部分在病人身上观察到的RBC和亚硝酸盐浓度刺激皮质匀浆，利用电子顺磁共振（EPR）光谱仪检测电子大鼠皮层匀浆中的NO释放和OGDHC活性。测定与血红蛋白结合的NO血红蛋白(Hb-NO)，并通过血红蛋白和铁离子(Fe-NO)形成亚硝酰复合物的形成来确定皮质匀浆中释放的NO。箭头表示分别对应于Fe-NO和Hb-NO的峰值。c.d NO是从亚硝酸盐中释放出来的,但大部分的NO以NO-Hb的形式留在红细胞内（c）。只有一小部分的NO被释放，形成Fe-NO复合物）释放的NO量远低于4μM(d）。e没有观察到对OGDHC活性的显著影响，甚至观察到由缺氧引起的OGDHC的抑制作用被RBC逆转. f. 但在缺氧后加入RBC不影响OGDHC的活性。
图4 谷氨酸积累对NG108-15细胞中OGDHC活性和随之而来的毒性的影响。选取NG108-15细胞为小鼠表达NMDA受体的神经母细胞瘤细胞系，虽然与原始神经元相比含有较少的受体，但该细胞可以在没有星形胶质细胞的情况下维持，并对谷氨酸的细胞毒性作用作出反应。a 确定谷氨酸诱导的细胞毒性效应在该细胞系中的阈值和时间过程。乳酸脱氢酶（LDH）的释放作为细胞损伤的标志。b. 5mM的谷氨酸导致所有神经元在48小时内近50%的死亡。使用TH、NO和SP来调节OGDHC的酶活性。观察到，由谷氨酸诱导的LDH的释放被硫胺素（TH）减少，而OGDHC酶抑制剂琥珀酰膦酸酯SP和NO，则提高了LDH c. 同样的结果反映在非存活细胞的数量上 d. 谷氨酸处理后，OGDHC的活性增加，与TH结合时效应特别增强，相反，在谷氨酸中加入NO和SP会抑制OGDHC的活性 e.补充TH降低了由NO和SP提高的细胞外谷氨酸的水平 f. 由于TH不仅是TCA循环中OGDHC的辅助因子，也是丙酮酸脱氢酶PDH的辅助因子。以下实验观察到，只有TH单补充增加了PDH活性，而其他处理（NO、SP）未影响它。表明，TH的有益作用是由于OGDHC的激活，而不是PDH的激活。
图5 OGDHC酶前体TH对用NO或谷氨酸处理的神经元（B35细胞系）释放LDH的影响。在B35细胞（一种大鼠神经母细胞瘤）也也证实了TH的作用。数据显示，NO或谷氨酸都会增加LDH的释放，而TH会逆转这些影响。这种保护作用在4小时（ a,c）和24小时后观察到( b,d)后观察到这种保护作用。
图6 小鼠间脑培养物中的多巴胺能（THir阳性）神经元数量和神经突生长情况。TH对谷氨酸毒性的有益作用也在原代大鼠间脑细胞中得到证实。大多数的细胞在与0.5和1mM的谷氨酸孵化15分钟后已经被杀死（b）。加入美金刚（一种NMDA抑制剂）后，这种效应大大降低，说明死亡途径是由该受体介导的（c，g）。同时，完整的神经元的典型形态（a）在谷氨酸处理后发生了改变（e），减少了神经元的长度（b,f)，并降低了酪氨酸羟化酶免疫反应细胞的数量（b,f)，TH增加了存活的神经元（酪氨酸羟化酶免疫活性细胞）的数量从22.8%增加到64.7%（0.5mM谷氨酸），18.6%增加到45.6%（1mM谷氨酸）。然而，TH并没有使神经元的长度正常化 (d,h）。
图7 硫胺素（TH）对谷氨酸诱导的细胞内游离Ca2+浓度（[Ca2+]i）变化的影响。为了进一步测试OGDHC的作用是否是由NMDA受体介导的，而NMDA受体主要是与Ca2+流入相联系。本文测定了大鼠大脑皮层的初级培养物中，谷氨酸和TH对细胞内Ca2+水平（[Ca2+]i）变化的影响。单个神经元对10μM谷氨酸的反应是通过Fura-2测量细胞膜游离Ca2+来评估（a）。通过加入1mM乙二醇-双（β-氨基乙酯）-N,N,N,N-四乙酸四钠(EGTA)来络合Ca2+，并加入1μM对三氟甲氧基苯腙(FCCP)来解除线粒体的偶联。细胞内最大的[Ca2+]流量是通过用离子霉素处理来验证的。在长期的实验中，我们发现谷氨酸引起[Ca2+]i快速但适度的增加（b），随后是[Ca2+]i的二次上升(c）TH的存在大大降低了对谷氨酸的反应中[Ca2+]i的大小。在应用谷氨酸的前2分钟，单个神经元的[Ca2+]i变化的曲线下面积（AUC）（d），表明[Ca2+]i的下降在实验后的第一秒内就已经很明显。
图8 硫胺素（TH）对培养的大鼠皮层神经元中谷氨酸（Glu）引起的线粒体膜电位（ΔΨm）变化的影响。图2中已经表明，OGDHC会影响谷氨酸的代谢，而不是氧化磷酸化。本部分进一步确定了线粒体膜电位在对10μM谷氨酸的反应。加入10μM的谷氨酸会使神经元的ΔΨm立即下降（Rh123荧光迅速增加）（b，c）。ΔΨm的长期二次下降，对应于[Ca2+]i的二次增加。[Ca2+]i（b），即所谓的延迟钙失调。为了估计TH对谷氨酸诱导的ΔΨm变化的影响，我们比较了用谷氨酸的前2分钟ΔΨ计算的曲线下面积（AUC）和谷氨酸加入后60秒Rh123反应的振幅（F/Fo）两种方法的结果相似（d）。TH减少了线粒体在用谷氨酸处理后的头2分钟内的去极化，延迟了ΔΨm的二次下降，这反映在Rh123荧光的逐渐增加上。(b,c），然而，TH并不影响线粒体在应用谷氨酸5分钟后观察到的最大线粒体去极化（b，c）。
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研究结论
这些数据表明，TH通过增强谷氨酸的消耗来改善线粒体的功能。而谷氨酸的毒性和神经元的凋亡，是由神经中的NO水平升高导致的，可以通过补充TH来限制。治疗性TH补充，通过激活OGDHC和增强谷氨酸的消耗来实现线粒体的功能，似乎在任何线粒体功能受到抑制的情况下都可能有效。
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讨论
该研究数据显示，在受伤的大脑中出现的低浓度的NO抑制OGDHC，但不损害氧化磷酸化OxPhos。结合NO的RBC的存在能稍微改善因缺氧而受损的OGDHC的活性，而存在临床相关的亚硝酸盐浓度和RBC则会逆转这一效果减少了OGDHC的平均活性（Scheme 1）。RBCs的有益作用是由于结合了内源性形成的NO。值得注意的是，很可能在SAH患者中，从RBC中释放的Hb表现出过氧化物酶活性，进一步加重了神经元和其他细胞的损害从而导致损伤相关分子模式（DAMPs）和谷氨酸的进一步释放。
使用OGDHC的辅酶前体TH和抑制剂SP，在神经元培养中确定了OGDHC的参与。值得注意的是，SP的作用和TH的作用是相互影响的，OGDHC的抑制可能会通过增加TH的运输来补偿。抑制OGDHC会减少线粒体对谷氨酸的摄取，导致谷氨酸在细胞质中的积聚。在神经元的细胞质中，谷氨酸总是分布于在能量池（由线粒体摄取）和囊泡池之间，在细胞质谷氨酸水平较高时，其进入线粒体的运输将达到饱和，这与囊状运输相反。
总之，本文这里描述了一种新的线粒体介导的神经元凋亡的途径，它是基于TCA循环中谷氨酸依赖部分的活动不足，而不是基于受损的OxPhos。这种途径可能发生在各种神经系统疾病中，并伴有神经炎症和产生的NO的升高。NO升高通过抑制OGDHC，触发了谷氨酸流从TCA循环转入储备囊泡池，并将其自发释放到细胞外液中，有利于兴奋性毒性作用和神经元死亡。这些影响可以通过大剂量的TH来防止，以治疗急性神经系统疾病。目前，250毫克/天是TH的常规剂量，1.5克/天用于成功治疗柯萨可夫综合征。在脑损伤的动物模型中，观察到TH的有益作用，每日剂量为400毫克/千克的大鼠，相当于人类的64毫克/千克。这个剂量与本文细胞实验中使用的剂量相当(1mM盐酸硫胺，337mg/L）。在这些剂量下，TH的毒性效应尚不清楚。目前的研究结果为今后高剂量TH的临床试验奠定了科学基础。
Scheme1 OGDHC介导的调控神经元死亡的途径
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