脓毒症:T细胞耗竭

厦门市第三医院重症医学科   吴彬翻译  叶华光审校

重症行者翻译组

介绍

脓毒症被定义为对感染产生失控的宿主反应进而导致致命性的器官功能不全。感染性休克定义为脓毒症的一个亚组，由于产生循环、细胞和生化代谢异常较之单纯的脓毒症具有更大的死亡风险。上一个10年需要住院治疗的脓毒症（既往成为严重脓毒症）人数是270（95%可信区间176-412）/10万人年。脓毒症发生率不断增长，即使预后有改善的趋势，大约三分之一的脓毒症患者会在医院死亡。从医院出院的脓毒症生存者数量不断增长，重点是，出院后约六分之一的脓毒症患者会在出院第一年内死亡。因此，脓毒症有着很高的早期和晚期不良预后（如死亡率）发生的风险，这些风险能够被干预措施降低。当前的治疗由支持治疗和抗生素治疗组成；并无特异性的干预措施被证实能降低感染相关的死亡率。因此，我们特别需要改善脓毒症患者预后的治疗策略。

在过去的三十年中，超过200项随机对照试验被证实无法改善脓毒症患者的不良结局。这些试验具有几个共同的特征。首先，候选的干预措施作用的人群异质性很高，这些怀疑或证实感染的患者具有各种导致急性器官功能障碍的可能病因。其次，候选干预措施的预期效果通常太大。最后，亚组通常是事后定义的，即使是先验定义的，预期治疗作用在试验设计阶段也没有对亚组的治疗效果进行明确。因此，这些试验的阴性结果可以用基线变异性来解释。在脓毒症人群中进行预后测试，脓毒症预期归因风险越低，候选干预措施的效果也越差，说明决定脓毒症预后的多种机制均未被候选干预措施所改变。

鉴于这些问题，有必要鉴别出患者中明确的脓毒症亚群 （实用性富集），更有可能从测试性干预措施（预测性富集）中受益或具有预后方面更大的风险（预后富集）。具有明确的治疗反应特征和可改变的生物学机制的脓毒症患者亚群被称为“可处理的特征”或“内表型”。在这个叙述性综述中，我们讨论了脓毒症患者中T细胞耗竭是否是一个可治疗的特征，主要使用来自人类研究的数据。

什么是T细胞耗竭

T细胞耗竭这一变化在癌症和慢病毒感染中最为典型。尽管当前仍然是一个需要深入研究的领域，在细胞和分子水平已经有关键的发现。耗竭的T细胞失去了他们的效应器功能，表现为产生细胞因子（如TNF-α，IFNγ，IL-2）的能力减弱，细胞毒作用降低，细胞增殖分化能力降低。这些效应器功能以一种渐进的方式丢失，首先是IL-2的产生、增值分化能力和体外细胞溶解作用的丢失，其次是 TNF-α，IFNγ的产生减少 ，最终耗竭的细胞由于过度刺激而死亡。

耗竭T细胞表面免疫检查点的抑制性分子表达上调。免疫检查点是免疫细胞维持自身耐受性和调节对危险信号免疫反应的抑制和刺激通路。在耗竭T细胞中研究较多的免疫检查点分子有上调的程序性细胞死亡分子-1(PD-1)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），淋巴细胞激活基因3（LAG-3），T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（TIGIT），T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（TIM-3），CD160和2B4。耗竭T细胞还改变了代谢，表观遗传和转录谱。尽管雷帕霉素（mTOR）驱动的合成代谢途径是上调的，糖酵解和线粒体代谢仍被抑制，这些变化可在感染早期发生。耗竭T细胞关键表观遗传异常是耗竭特异性区域的染色质可达性更大，这与记忆T细胞有根本的不同。耗竭T细胞整体转录程序失调，其转录因子包括PRDM1 / BLIMP1，EOMES，BATF，MAF，NFAT和TBX21/T-bet上调或下调。脓毒症患者T细胞耗竭的关键后果就是免疫抑制。在健康的人群中，当T细胞被激活时，它们会分泌一系列细胞因子和趋化因子将先天免疫细胞募集到感染部位，增强其杀微生物活性，帮助B细胞产生抗体，发挥离体溶细胞活性，并产生包括长寿的记忆T细胞在内的T细胞亚群。T细胞耗竭会削弱病原体清除的能力，可能延长原发感染持续时间，增加医院感染和休眠病毒再激活的风险，并可能增加脓毒症相关器官功能不全持续时间，从而导致住院时间的延长及增加死亡风险。

脓毒症中T细胞耗竭的间接和直接证据

脓毒症中T细胞耗竭的间接证据来自全淋巴细胞转录组研究。适应性免疫系统变化的主要部分在这两项研究中均被发现。在Davenport及其同事的研究中，全淋巴细胞转录组显示出明显的T细胞功能活化，细胞死亡和凋亡，T细胞受体复合物是关键的上游调节因子。T细胞相关信号通路的主要变化（如iCOS，CD28，OX40，IL-4和mTOR），尽管程度不同，但都取决于脓毒症的亚表型，Scicluna及其同事也观察到了这一现象。

T细胞耗竭的直接证据来自Boomer和同事的开创性工作。应用迁延性脓毒症死亡患者死后收集的脾细胞进行T细胞效应功能分析，通过给予抗CD3 / CD28抗体体外离体刺激造成的细胞因子释放来评估。他们也确定了脾细胞表面的PD-1和 CTLA-4的表达。这项研究发现脓毒症患者对体外刺激造成的细胞因子产生能力下降同时高表达抑制性的免疫检查点分子，证实存在T细胞耗竭。其他作者也发现在脓毒症患者队列中存在T细胞耗竭，主要是通过抑制性免疫检查点分子在细胞表面和血清中高表达证实。PD-1和PD-L1在T细胞和B细胞中表达上调，记忆细胞与幼稚细胞相比有更高的表达，而PD-1的高表达与死亡风险增加相关。在生存一年以上的脓毒症患者中PD-1和PD-L1通路仍然异常。

在脓毒症患者分离的细胞中T细胞耗竭是可逆的

Patera及其同事研究了应用抗体被动阻断 PD-1和PD-L1前后的白细胞功能。白细胞来自于脓毒症患者、非脓毒症的危重患者和健康对照者。脓毒症患者的中性粒细胞和单核细胞功能下降，与CD8+ T细胞和自然杀伤细胞特有的PD-1和PD-L1表达相关。有趣的是，CD8+ T细胞效应功能的下降（如IFNγ的产生能力）与中性粒细胞中升高的PD-L1表达相关。作者报道应用抗PD-1或PD-L1抗体后恢复了中性粒细胞和单核细胞的功能。Chang和他的同事也评价了抗PD-1和PD-L1抗体在脓毒症患者和合并脓毒症的重症患者中的作用。该作者报道了在给予抗PD-1或PD-L1抗体处理后脓毒症患者的白细胞凋亡减少，T细胞效应功能明显恢复，表现为 IFNγ和IL-2的产生显著增加。MDR细菌感染处理十分困难。Thampy 及其同事报道了包含24名存在MDR细菌感染的脓毒症患者病例系列。

这些患者的免疫分型均有T细胞耗竭的证据。作者分析了给予IL-7, 抗-PD-L1和OX-40配体刺激后细胞分泌 IFNγ的比例，发现IL-7反应最好62.5%， OX-40 L次之为41.6%，而抗-PD-L1为33.3%。

抗PD-1或PD-L1免疫治疗的病例报告

真菌感染中的毛霉菌感染处理起来十分困难。一名此前健康的30岁多发伤合并烧伤患者进展为毛霉菌感染，患者此前刚刚罹患一次脓毒症。免疫分析发现淋巴细胞绝对值降低、单核细胞HLA表达降低、T细胞上的PD-1表达增加。由于毛霉菌对血管结构的侵袭性，使用清创术来进行病因控制并不可行。患者对两性霉素B脂质体和泊沙康唑的联合抗真菌药物治疗没有反应。但在给予一周三次IFNγ和一次单剂量250mg的尼鲁单抗治疗后病情明显好转。

逆转脓毒症患者T细胞耗竭的早期随机对照试验

有两个近期的一期随机对照试验评估应用抗PD-L1单克隆抗体(BMS-936559)和抗PD-1抗体（尼鲁单抗）被动免疫治疗是否能够逆转合并脓毒症和淋巴细胞减少（淋巴细胞绝对计数≤1.1 × 103 /μl）的成人重症患者的免疫抑制。抗PD-L1单克隆抗体(BMS-936559)在20名脓毒症患者中应用逐步升级的剂量（从10mg到900mg），4名脓毒症患者作为对照组。在给予900mg的BMS-936559注射28天后受体占据率大于90% 。并无证据表明更高剂量的BMS-936559应用28天以后药物引起额外的细胞因子产生 、无剂量相关的副作用增长、免疫功能改善。抗PD-1单克隆抗体（尼鲁单抗）在15例病人中给予480mg，另外16例病人给予960mg作为对照组。这两个剂量注射28天后受体占据率均大于90%  。在两种剂量应用28天以后并无证据表明药物引起额外的细胞因子产生、无剂量相关的副作用增长和免疫功能改善。作为早期试验，两者的关键目标都是确定药代动力学和药效学，重点是安全性。在这两项试验中均观察到脓毒症改变了容量的分布以及绝大多数药物的峰值浓度。令人鼓舞的是两种干预治疗都没有产生细胞因子风暴。因此，可能有机会考虑未来在成人重症脓毒症患者中开展应用免疫检查点阻断治疗的临床试验。恢复淋巴细胞计数和功能也可以通过应用IL-7达到。

 这个假设在一项24例脓毒症合并严重淋巴细胞减少（定义为淋巴细胞绝对数值≤0.9 × 103 /μl）的空白对照、双盲、三臂随机对照试验中应用重组IL-7(CYT107)进行了检验。CYT107 以两种不同剂量给予，低频率一周一次10 μg/kg肌肉注射，高频率一周两次10 μg/kg肌肉注射，疗程4周。应用CYT107后免疫效应细胞CD4+ 和CD8+T细胞显著的丢失被逆转，活化的CD4+ T细胞标志物增加，同时PD-1表达并未增加。意味着脓毒症患者减弱的淋巴细胞功能得以改善。

未来逆转脓毒症患者T细胞耗竭的临床试验设计

要讨论这一问题PICO框架是一个非常有用的架构。在三个早期试验中，研究者应用低淋巴细胞计数将脓毒症患者富集。淋巴细胞减少发生在70%的脓毒症患者，常常在三天左右达到最低值。随着淋巴细胞减少程度的增加和维持时间的延长（三天或更长时间）死亡风险增加。在这些早期试验中，淋巴细胞减少作为预后富集和免疫抑制的标志物来讨论。淋巴细胞减少是淋巴细胞耗竭的代表以及淋巴细胞计数的恢复是脓毒症患者免疫重建的标志这样一种观念并无直接的证据支持。我们对驱动脓毒症患者T细胞耗竭的分子机制了解的很少。考虑到脓毒症和癌症及慢性感染重要的免疫差别，有必要了解脓毒症中T细胞耗竭的分子基础。需要鉴别出预测富集标志物。对未来临床试验中三个干预药物的剂量应是早期试验中最高耐受剂量。由于持续性淋巴细胞减少是一个更好的预后富集标志，而淋巴细胞计数的最低点发生在收住ICU 后三天左右，这可能代表了免疫调节措施更好的干预时间节点，因为这个时间点排除了无法干预的早期死亡病例。对照组应给予标准治疗并预先定义。 这些干预措施的终点应该是院内感染或死亡。重要的是认识到由院内感染引起的归因死亡风险最低是15%，而它影响研究设计时的样本大小。免疫检查点抑制治疗的两个可能的副作用是炎症因子风暴和自身免疫风险，这些需要在未来的试验中作为关键的副作用来研究。

结论

脓毒症免疫抑制的一个表现是T细胞耗竭。可以用流式细胞技术检测出这一表型，其特点是免疫检查点抑制分子如PD-1,、LAG-3和 CTLA-4表达增加 。T细胞耗竭增加不良预后的风险。单克隆抗体可有效对抗这些抑制性分子的作用 ，早期临床试验提示IL-7、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体应在更多的T细胞耗竭脓毒症患者中进行测试。