编者按：千里黄云百日曛，北风吹雁雪纷纷。本期，文献荐读栏目肺癌主编——中国医学科学院肿瘤医院胡兴胜教授进行肺癌领域的相关文献荐读。医者“胜”也，共赴一场思想之约。
第二期
肺癌主编胡兴胜教授力荐
史慧洋编译：《肺癌免疫治疗的预测性生物标志物: 来自国际肺癌研究协会病理研究委员会（IASLC）的观点》
专家简介
胡兴胜 教授
中国医学科学院肿瘤医院内科主任医师、硕士生导师
中国医药教育协会肿瘤化疗专业委员会副主委/秘书长
中国医疗保健国际交流促进会肿瘤内科分会常委
中国老年肿瘤学会微生物专业委员会常委
中国中医药研究促进会肿瘤专业委员会常委
史慧洋
北京协和医学院2022级硕士研究生
研究方向：胸部肿瘤的化疗、靶向治疗、免疫治疗等。
研究背景
近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）显著改善了部分晚期NSCLC患者的生存，也越来越多地应用于早期肿瘤的新辅助和辅助治疗。然而，ICIs仅对一小部分患者产生有意义的治疗作用。现有免疫治疗的主要预测生物标志物是PD-L1蛋白，但它并非完美的生物标志物，在实际应用中存在诸多问题。同样，肿瘤突变负荷(TMB)作为ICIs的预测生物标志物也存在多种技术问题。目前正在进行的关于肿瘤和宿主免疫特异性因子的研究利用多模型分析已经确定了可更准确预测疗效和预后的免疫治疗生物标志物。
本综述由国际肺癌研究协会病理研究委员会（IASLC）发布，概述了各种可能有助于预测NSCLC的ICI反应的生物标志物，包括PD-L1免疫组化和TMB的最新数据、肿瘤抗原、遗传和表观遗传标记、免疫微环境的IHC评估，以及新辅助免疫治疗的微生物组和病理反应评估等等，旨在强调预测性生物标志物的联合应用优于单个标志物的使用，并有助于在临床实践中使用多模型方法更准确地评估疗效。
研究过程和结果
一．PD-L1作为肺癌免疫治疗的预测生物标志物
目前，Pembrolizumab、Cemiplimumab-rwlc、Atezolizumab等药已被批准用于PD-L1高表达(≥50% TPS或≥50%肿瘤细胞染色或染色肿瘤浸润免疫细胞≥10%肿瘤面积)的晚期NSCLC的一线治疗。一些回顾性分析和历史对照研究没有发现IO单药治疗或联合化疗之间的疗效差异，表明在PD-L1高表达的患者中，使用派姆单抗的IO单药治疗是治疗首选。许多指南指出，对于PD-L1高表达人群(约30%的NSCLC)，应减少化疗使用。一项回顾性分析显示，在PD-L1表达极高群体(TPS 90%)中，IO单药治疗会有更好效果；相反，低或无PD-L1表达者PD-L1单抗联合CTLA-4单抗疗效更佳。
在不同组织学亚型上的预测价值：通过对大量患者的回顾性分析，与腺癌相比，PD-L1的在鳞状细胞癌中没有预测价值。此外，与NSCLC相比，SCLC的PD-L1表达普遍较低，目前尚未发现PD-L1表达水平对SCLC有预测作用。
尽管上述预测模型相对简单，但仍存许多问题：首先，PD-L1的表达在空间和时间上存在异质性，并可能在肿瘤不同原发和转移部位间有差异；其次，PD-L1表达的连续分布使得确定可靠的cutoff值变得困难；最后，PD-L1 IHC与其他标记物(如TMB、基因表达谱(转录组特征)、多重IHC和多重免疫荧光(mIF) 对肿瘤微环境(TME)组分分析)联合应用是否比单独应用PD-L1 IHC有更强的预测性能也需要规范化评估。例如，我们已经知道PD-L1高表达与高TMB没有显著重叠，故联合应用PD-L1和TMB可能比单一生物标志物有更准确的预测能力。
二．TMB、肿瘤抗原、遗传和表观遗传标记
若要将TMB作为免疫治疗生物标志物，我们仍需确定TMB状态与其相应的最佳治疗方法、TMB预测cutoff值的准确定义、标准化测序板的设计和尺寸，以及需要强大而严谨的技术和信息学，才能在不同的实验室间进行精准的TMB测量。FDA批准的TMB试验是一项2期多队列、开放标签、非随机的研究，涉及10种晚期不可治愈实体肿瘤（包括小细胞肺癌）的研究：在790名患者中，tTMB-H组总体缓解率为29%，而非tTMB-H组为6%，数据表明tTMB-H组抗PD-1单药治疗比标准治疗具有更大的生存益处。然而当ICI与化疗联合使用时，或者当双重ICI与单一ICI治疗进行比较时，这种差异并不明显。
此外，人们对肿瘤抗原的研究也产生了新兴趣：首先，肿瘤抗原反应的数量和质量可提高其预测能力，而肿瘤抗原的丢失则是免疫逃逸和ICI耐药的机制。其次，肿瘤抗原疫苗和T细胞过继疗法正在研发中。由于尚无标准化方法，目前仍依靠生物信息学分析对肿瘤抗原进行鉴定(HLA分型、肿瘤抗原肽推断、MHC结合预测和候选抗原肽选择)。在非小细胞肺癌中，每个肿瘤的肿瘤抗原中位数预计在63-214.40间，其数目与PD-L1的表达和吸烟相关基因组的表达呈正相关。
遗传标记研究方面，近一半的NSCLC存在可靶向的驱动突变。其中ALK重排或EGFR突变的患者对ICI治疗反应较差，而MET外显子14跳跃突变的患者对ICI治疗敏感。KRAS和TP53共突变与TME的T细胞富集的相关，而STK11/LKB1和/或KEAP1突变与KRAS共突变与TME的T细胞减少相关。此外，B2M的截断突变和杂合性丧失与ICI获得性耐药相关。表观遗传方面，编码免疫检查点或肿瘤相关抗原的基因启动子甲基化，通过阻碍抗原提呈、T细胞迁移和细胞因子分泌来影响ICI反应。
三．肿瘤免疫微环境
我们对癌症免疫认识的进步极大地促进了抗癌免疫治疗的发展。肿瘤-免疫相互作用是一个动态的时空过程，涉及在一个周期不同阶段起作用的多种刺激因子和抑制因子。目前免疫疗法的主流——ICIs可重新激活TME中受抑制的效应T细胞来杀伤肿瘤细胞。TME中活化的T细胞浸润通常伴随着IFN-g驱动的适应性免疫抵抗表型，可实现免疫调节途径上调：包括免疫抑制受体表达上调，其他抑制分子增多，或免疫抑制细胞群体扩增等。评估T细胞有无功能障碍还应基于其活化、调节、分化、增殖等各环节对各种标记物进行评估。
在多重分子或途径中，一些驱动因素在特定情况下介导免疫逃避的发生。LAG-3表达升高与较短或较长的PFS相关，这种明显矛盾现象的原因尚不清楚，可能由于使用了不同队列、应用了不同的组织成像平台和标志物临界值等。此外，骨髓间充质干细胞、循环外周血单核细胞都是反映患者免疫状态的生物学相关信息的潜在来源，可预测PD-1单抗的疗效和治疗后各种免疫细胞的百分比的变化。
四．转录组标记物
近年来有许多预测ICIs反应的转录组标记物发表，这些标记物从公共数据库或特定研究中检索得到，通过靶向或全转录组RNA测序获得mRNA数据，已在不同的队列和数据集上用不同的算法进行了验证以确定基因功能或确定预设的基因集相关性是否具有统计学意义。
这些预测性转录组标记物考虑了与肿瘤抗原性、T细胞启动与激活的树突状细胞相互作用的基因集，包括促进T细胞在肿瘤中的运输和浸润基因(CXCL9, CXCL10, CCL5基因等)、T细胞对癌细胞的识别基因(HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M基因)、抑制性细胞(如MDSCs和Tregs)或分子的浸润基因，以及免疫检查点受体或配体编码基因等。许多预测信号（IFN-g相关基因、T效应子和免疫细胞溶解活性）都强调了T细胞炎症和功能障碍的预测作用。T细胞炎症基因表达谱已在一项针对20种肿瘤类型(包括小细胞肺癌)进行的全肿瘤临床试验(KEYNOTE-028)中被验证为Pembrolizumab单药治疗的独立预测生物标志物。效应T细胞 IFN-g基因的高表达也与Atezolizumab和Durvalumab的疗效改善相关。最近发现，独立于PD-L1 TPS和TMB的27个基因的IO评分有助于确定能在临床中受益于IO的患者。
五．TME评价新技术
由于参与对ICIs反应的预测免疫细胞标记物和细胞因子过多，已广泛应用多重平台评估这些预测标记物，确定效应T细胞的功能状态、免疫抑制通路的状况，以及TME中免疫抑制群体的范围。免疫肿瘤学发展中的新方法主要包括以下内容:(1) 多通道无细胞或循环肿瘤DNA（ctDNA）分析的液体活检：靶向ctDNA组技术目前在临床上用于基因突变的识别、TMB的测量和治疗后疾病反应的监测；(2)高度复用的空间分辨组织分析：多重免疫荧光能同时绘制8到10个标记，更适用于临床中的预测标记验证。相比之下，高度复用的空间分辨技术专用于发现新的生物标记物，可容纳10到1000种标记；(3)来自细胞悬浮液的高维单细胞蛋白质组学和/或转录组学研究：单细胞RNA测序可检测单细胞基因表达的细微差别，并能够评估特定细胞亚群、药效学变化和肿瘤内异质性。一般来说，这些技术需要精密的仪器和相对复杂的信息学来进行分析和解释，目前已广泛应用于研究和生物标志物的发现。
六．微生物组
微生物组为定植于人体的共生生物的动态集合，它对机体抗癌免疫和免疫治疗反应有影响，其确切机制尚不清楚。肠道共生菌群可通过模式识别受体与黏膜免疫细胞“对话”，预防病原微生物感染并调节宿主免疫。几项临床前研究表明，肠道微生物组对ICIs在实体瘤中的疗效有影响。2018年Routy等人的研究显示，肠道微生物组多样性高的NSCLC患者对ICI的治疗反应较好。在PD-1阻断治疗后3个月内给予抗生素治疗的NSCLC患者，肠道生态失调，肠道微生物群发生改变，生存率降低。此外，肺部微生物群也可能影响ICI的治疗反应。一项非小细胞肺癌的研究显示，部分患者肺部微生物群改变，导致口腔共生菌群异常增加，与肿瘤进展和预后不良相关。
除了细菌之外，共生真菌、病毒和原生动物也是人类微生物群的组成部分，在肿瘤免疫监视中发挥着重要作用。目前的研究主要集中于细菌微生物群的多样性和丰度，采用宏基因组测序、16S核糖体RNA基因测序和定量聚合酶链反应技术对粪便或呼吸道样本的选定细菌进行检测。然而，评估肠道/呼吸道微生物组的最佳方法尚未确定，各种内外因素(如种族、饮食、吸烟、抗生素或其他环境暴露)的潜在影响尚不清楚，我们仍需对复杂的肿瘤-微生物组-免疫轴以及微生物生态与宿主免疫间的相互作用进行更多的研究。
七．IO新辅助治疗的主要病理反应
主要病理反应(MPR)和完全病理反应(CPR)已被用作肺癌患者各类新辅助治疗的临床替代终点。CPR可能是总生存期的替代指标，然而化疗后仅4%-12%的病例能达这一终点，不是十分理想。而新辅助化疗后的MPR（手术切除标本中原发肿瘤部位的存活肿瘤细胞≤10%）率高于CPR率。MPR已经在不同类型的标本和肿瘤的治疗中标准化，但新辅助手术切除的肺癌标本的标准化方法仍有待探索，主要包括如何确定整体处理的标准化方法、MPR的组织学标准、以及不同类型新辅助治疗方式对组织学特征的意义、淋巴结反应的评估以及不同组织学类型肿瘤的cutoff值等。
目前新辅助治疗后病理学评估的IASLC多学科建议和对PD-1阻断反应的泛肿瘤病理学评分正在尝试解决这些问题。泛肿瘤病理学评分系统认为残余存活肿瘤包括瘤内间质，而IASLC建议残余存活肿瘤仅包括存活肿瘤细胞。 初步研究数据，鳞状细胞癌≤10%存活肿瘤的cutoff值是接受IO治疗患者总生存期的预测指标，表明其最佳cutoff值是10%存活肿瘤。此外，最近肺癌新辅助化疗的回顾性研究显示，淋巴结病灶是疗效的关键决定因素，只有MPR和无残留淋巴结病灶的患者才具有生存优势。目前，临床反应也以RECIST为标准进行放射学评估。许多研究显示，相当数量组织学CPR的肿瘤在放射学上被评价为病情稳定（SD）或部分缓解（PR），故放射反应不是独立的预后因素。此外，一项临床研究显示ctDNA清除与CPR相关，这提示ctDNA分析可以作为新辅助IO疗效的预测标记物。
主编评语
虽然目前IO空间中有大量单个预测性生物标志物的数据，但多个单一生物标志物之间预测效果的头对头试验十分有限，PD-L1 IHC仍是最常用的预测性生物标志物。由于免疫系统和肿瘤细胞之间存在复杂的相互作用，单个生物标志物的预测能力有限，可能需要进一步开展包括各种生物标志物在内的全球性评估来改善生物标志物对ICIs治疗效果的预测能力。
尽管许多证据表明，生物标志物的联合应用可以更好地预测ICIs的治疗效果和预后信息，但我们仍需要通过前瞻性试验（最好是临床试验）对所选组合的预测性能进行测试和比较，以客观评估其预测效果。此外，预测性生物标志物还需要具有临床实用性。随着技术的不断进步，我们可能会发现更容易在临床中实施的新的生物标志物，从而更好地应用于免疫疗法，以及更好地适应尚未完全理解的原发性和继发性耐药机制。
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