变性蛋白的免疫沉淀方法 (IP / Denatured)
当蛋白质处于正常天然构象时,某些抗体所识别的表位未能暴露出来,这种情况下需要采取下列方法进行变性蛋白的免疫沉淀.
A.所需溶液和试剂
注意：所有溶液均需要用Milli-Q超纯水或是相当纯度的其他水配制。
1. 变性细胞裂解液：50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β-巯基乙醇 (β-ME)。β-ME需新鲜加入，加入后先煮10分钟。
2. 细胞裂解液 (1X): 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4，1μg /ml Leupeptin.
注意：使用之前加入1 mM PMSF。
3. 蛋白A琼脂糖微球：取1.5 g 蛋白A琼脂糖微球加入到5 ml的1X PBS中。4°C缓慢搅拌2小时。离心沉淀微球，用PBS清洗两次。将微球重悬在1倍体积的PBS中。（处理后的微球可以在4°C存放2周）
4. 3X SDS上样缓冲液：187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25°C), 6% w/v SDS, 30% 甘油, 150 mM DTT, 0.03% w/v溴酚蓝。
B. 细胞裂解样品制备
1. 吸去培养基。加入含调控因子的新鲜培养基，处理所需的时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，弃去培养基，用PBS清洗一次。
3. 弃去PBS，每个板（150 x 25 mm）中加0.4 ml变性细胞裂解液（使用前预煮10分钟）。
4. 立即将所有细胞刮下，收集到2.5 ml的管中。
5. 沸水中煮10分钟。
6. 加入4倍体积（1.6 ml）冰冷的1 X细胞裂解液。所得即细胞裂解物。如有必要，样品裂解物可以保存在–80°C。
C. 免疫沉淀
1. 将一抗加入到200 μl细胞裂解物中，在4°C的转子上孵育过夜。
2. 加入20 μl 50%浆状的蛋白A琼脂糖微球。在4°C的转子上孵育1~3个小时。
3. 4°C离心30秒。沉淀用500 μl细胞裂解液洗五次，洗完置于冰上。
4. 将沉淀用20 μl 3X SDS上样缓冲液重悬沉淀。涡旋震荡，离心30秒。
5. 把样品放在95–100°C加热2-5分钟。
6. 取15-30 μl样品，上样到SDS-PAGE胶（12–15%）上。
7. Western免疫印迹分析检测（参考 Western Immunoblotting方法）。
天然蛋白的免疫沉淀方法(IP / Native Protein)
本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于western免疫印迹或是激酶活性分析
A. 所需溶液和试剂
注意：所有溶液用反渗透去离子水（Reverse Osmosis Deionized water, RODI）或相当纯度的水配制。
1. 20 X 磷酸盐缓冲生理盐水 （PBS）: (#9808) 配制1L 1 X PBS时，取50 ml 20 X PBS用950 ml RODI水稀释到1L，混匀。
2. 10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制1 L 1 X细胞裂解液时，取100 ml 细胞裂解液加950 ml RODI水稀释到1L，混匀。注意：使用前添加1 mM PMSF。
3. 蓝色上样缓冲液（SDS上样缓冲液）：（#7722）。 配制新鲜的3 X还原性SDS上样缓冲液，在3X SDS上样缓冲液中加入十分之一的30X的还原剂（1.25M）。
4. 蛋白A或G琼脂糖微球（用于未标记的一抗）：（处理后可以在4°C保存2星期）。按照产品说明处理。蛋白A用于兔IgG抗体的沉淀，蛋白G用于小鼠IgG抗体的沉淀。
5. 固定有抗生物素蛋白Streptavidin的微球（用于生物素标记的抗体）: (#3419) 用前稍加震荡，每个免疫下拉反应用10 μl。
6. 10X 激酶缓冲液:（#9802） 配制1 ml 1X激酶缓冲液时，取100 μl 10 X激酶缓冲液用900 μl RODI水稀释到1ml，混匀。
7. ATP (10 mM): （#9804） 配制0.5 ml 200 μM ATP时，取10 μl ATP（10 mM）加入到490 μl 1X 激酶缓冲液中。
B. Preparing Cell Lysates细胞裂解物制备
1. 吸去培养基。加入含调节因子的新鲜培养基，处理所需的时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去掉培养基，用冰PBS清洗一次。
3. 去掉PBS，每个板（10cm）中加0.5 ml冰预冷的1 X细胞裂解液，在冰上孵育5分钟。
4. 将所有细胞刮下，收集到一个离心管中。置于冰上。
5. 冰浴中对样品用超声处理3次，每次5秒钟。
6. 4°C，14000 X g离心10分钟。将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。如有需要，样品可以保存在-80°C。
C. 免疫沉淀
细胞裂解物预处理（对于未标记或生物素标记抗体而言是可选步骤）
1. 取200 μl 1 mg/ml的细胞裂解物，在其中加入10–30 μl 50%的蛋白A或G琼脂糖微球浆（用于未标记的一抗）或10 μl抗生物素链菌素微球（用于生物素标记的抗体）
2. 4°C孵育30-60分钟。
3. 4°C离心10分钟。将上清转移到新的管中。
4. 根据所用一抗选择下面合适的操作步骤进行实验。
使用未标记一抗
1. 14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入一抗。在4°C转子上孵育过夜。
2. 加入蛋白A或G琼脂糖微球（10-30 μl 50% 微球浆）。4°C转子上孵育1-3个小时。
3. 4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。
4. 取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析（见下文）。
使用生物素标记的一抗
1. 14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入生物素标记的一抗。在4°C转子上孵育过夜。
2. 稍加震荡。加入固定化抗生物素链菌素（与微球偶联）（#3419）（10μl）。在4°C转子上孵育2小时。
3. 4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。
4. 取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析（见下文）。
使用固定化抗体（与微球偶联）
1. 14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入固定化抗体10 μl。在4°C转子上孵育过夜。
2. 4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。
3. 取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析（见下文）。
D. 样品分析
继续下述任一种操作：
Western免疫印迹分析
1. 将沉淀用20 μl 3X SDS上样缓冲液重悬。震荡后离心30秒。
2. 把样品放在95–100°C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。
3. 取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶（4–20%）上。
4. Western 免疫印迹分析检测（参考 Western Immunoblotting方法）。
注意：对于分子量约为50 kDa的蛋白，我们推荐使用小鼠抗兔IgG（轻链特异）（L57A3）mAb #3677或小鼠抗兔 IgG（构象特异）（L27A9）mAb #3678作为二抗，以减少变性重链产生的遮蔽作用。对于分子量接近25 kDa的蛋白，推荐使用小鼠抗兔IgG（构象特异） （L27A9）mAb #3678。
激酶活性分析
1. 沉淀用500 μl 1X激酶缓冲液清洗2次。置于冰上。
2. 将沉淀用添加有200 μM ATP和底物的40 μl 1X激酶缓冲液重悬沉淀。
3. 30°C孵育30分钟。
4. 加入20 μl 3X SDS上样缓冲液终止反应。震荡后离心30秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到新的管中。
6. 把样品放在95–100°C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。
7. 取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶（4–20%）上。
IP浓缩的检测和定量
1. 定量的方法（标准PCR，定量PCR，CHIP-on-chip，CHIP测序）。
2. PCR的循环数和目的DNA位点的检测。
3. 2%的总DNA经过一系列的连续稀释后，是否进行了PCR分析（在G部分，步骤1有描述）？
4. 使用这个引物进行一系列连续稀释DNA的PCR 是否是线性的？
5. 使用所选定的引物，估算出来的PCR的有效性是多少（仅针对定量PCR使用者）？
6. 组蛋白H3抗体(#4620) 对照是否浓缩了对照RPL30启动子的DNA？如果有的话，百分之一的总染色质添加到IP反应中，浓缩的数量为多少？
7. 使用正常兔子IgG (#2729) 浓缩RPL30启动子的DNA，百分之一总染色质的数量是多少？
8. 组蛋白H3抗体(#4620)对照是否浓缩了目标位点的DNA？如果是的话，百分之一的总染色质，它的浓缩数量是多少？
9. 使用正常兔子IgG (#2729) 浓缩目标位点的DNA，百分之一总染色质的数量是多少？
10. 测试抗体是否浓缩了目标位点的DNA。如果有，百分之一的总染色质的数量是多少？
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