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PTMScan® Proteomics Kit Protocol
I．细胞裂解和蛋白酶切
A．需要提前订购或者配制的溶液和试剂
以下试剂不包含在本试剂盒中，需要另外订购:
1. HEPES (Sigma, H-4034)
2. Sodium pyrophosphate(Sigma, S-6422)
3. β-glycerophosphate(Sigma, G-9891)
4. Urea, Sequanal grade(Thermo Scientific, 29700)
5. 钒酸钠(Sigma, S-6508)
6. Iodoacetamide (Sigma,I-6125)
7. Dithiothreitol (DTT)(Cell Signaling Technology, 7016)
8. Trypsin-TPCK(Worthington, LS-003744)
9. Trypsin (Promega,V5113)
10. Lysyl Endopeptidase,LysC (Wako, 129-02541)
11. Trifluoroacetic acid(TFA), Sequanal grade (Thermo Scientific, 28903)
12. Trifluoroacetic Acid(TFA), Reagent grade (American Bioanalytical, AB02010)
13. Acetonitrile (ThermoScientific, 51101)
14. Sep-Pak®Classic C18 columns, 0.7 ml (Waters, WAT051910)
15. Burdick and JacksonWater (Honeywell, AH365-4)
16. 1x Phosphate-bufferedsaline (PBS) (Cell Signaling Technology, 9808)
17. HEPES (Sigma, H-4034)
18. 1 mM Hydrochloric acid(HCL)
19. Ammonium bicarbonate(Sigma, A-6141)
注意：细胞裂解液（操作步骤第I部分）、Sep-Pak纯化相关溶液（操作步骤第II部分）和IAP富集相关溶液（操作步骤第III部分）请用反渗透去离子（RODI）或等效级水配制。肽段浓缩的步骤相关溶液（操作步骤第IV和V部分）请用HPLC级水（Burdickand Jackson water）来配制。
储存液配制：
1. 50ml 200 mM HEPES, pH 8.0 溶液的配制步骤：
1）称取 2.38g HEPES 溶于45 ml 去离子水中，用5M NaOH 调pH 值到8.0.
2）5M NaOH 配置如下：称取2g NaOH 溶于10ml 去离子水中，充分混匀；
3）用去离子水定容200 mM HEPES到50ml，并用0.22um 的滤膜过滤；
2. 25X（62.5mM）焦磷酸钠储存液：称取1.1克焦磷酸钠盐，溶于 40毫升去离子水中，可在4°C保存长达六个月。
3. 1000X β-甘油磷酸钠储存液： 称取2.2 克β-甘油磷酸钠，溶于10毫升去离子水中，并分装为100ul每管，于-20°C保存。
4. 50ml 100X（100 mM）钒酸钠储存液的配制步骤：
1）称取0.92g 钒酸钠溶于45 ml 去离子水中，混匀，用1 M NaOH 或者1 M HCl 调PH 值到10（溶液的颜色为黄色），并不时颠倒或者搅拌混匀。
注意：由于生产来源不同，钒酸钠水溶液的起始PH 值可能会不一样。如果是来源于Sigma，起始PH在12左右，需要用HCl调PH到10。
2）通过沸水浴加热，直到黄色的溶液变为无色，然后冷却至室温。
3）再次调PH值到10（如果钒酸钠是来源于Sigma，此时需要用NaOH调PH值），并再次通过沸水浴加热，直到黄色的溶液变为无色，然后冷却至室温。
4）再次测PH值，直到溶液的PH 稳定在10，最后用去离子水中定容到50ml。
注意：激活的钒酸钠需要分装为1ml/管，于-20°C保存。每管只能解冻一次使用（如果一次用不完请丢弃，不能反复冻融），如果溶液的颜色变黄请不要再使用。
5. 1.25M 二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)溶液的配制
称取9.625克DTT，溶于50ml去离子水中，混匀后分装为200ul/管，并于-20度保存，请不要反复冻融。
6. 尿素裂解液配置步骤
1）称取27g的尿素溶于15ml 去离子水中，并加入5ml of 200 mM HEPES（pH 8.0）、2ml 焦磷酸钠25X储存液、50 μl ß甘油磷酸盐1000X储存液，通过搅拌或者震荡混匀。
注意：尿素溶解的过程中会吸热，可以用37度温水浴帮助溶解（请不要用热水浴）。
2）待尿素完全溶解，加入0.5 ml 激活的100 mM钒酸钠溶液，并用去离子水定容到50ml，混匀。
此时若不及时做实验，可以放到-80度保存。
注意：所以的试剂都需要用去离子 水配置或者同样规格的去离子水；不要用任何去垢剂，如Triton X-100、PEG 等，这些去垢剂会影响后续的质谱分析；
尿素必须是Pierce 测序级别的 (catalog #29700), 其他试剂可以从Sigma 或其他同等高品质的供应商购买；
7. 碘乙酰胺溶液（Iodoacetamidesolution），快速称取95mg 碘乙酰胺粉末，转移到用锡纸包裹的15ml离心管中，用3ml去离子水混匀至溶解，并定容到5ml，避光保存。
注意：碘乙酰胺溶液容易见光分解，每次使用前现配；
8. Trypsin-TPCK储存液：根据订购的Trypsin-TPCK的含量，制备1mg/ml的储存液，用1mM盐酸进行溶解，并分装为1ml/管，在-80°C可存放一年。例如，5mg的Trypsin-TPCK干粉，加5ml1mM盐酸进行溶解即可。
注意：Trypsin-TPCK的干粉可在密封容器中，-80°C储存长达2年。Trypsin-TPCK干粉一定要避免收集水分，否则会导致试剂降解，建议尽快配制。由于胰酶容易吸湿，一般是一整瓶一次性配完后分装保存。
B.悬浮细胞样品的制备
悬浮细胞样品：
1. 每组实验，培养达到70-80%的汇合率的1~2 ×108个细胞（约10个15cm直径的大培养皿对应的细胞数，需要能够产生10~20mg的可溶性蛋白）。
2. 130×g离心5分钟，收集细胞。小心去掉上清，用20ml冷的PBS清洗细胞，离心，去掉上清，然后加入10ml尿素裂解液（室温，不要预冷）到细胞沉淀，并颠倒混匀几分钟以充分裂解细胞。注意：此处可以暂停并将收集的细胞裂解物冷冻保存在-80°C一个月。
3. 使用3mm超声探头的超声仪对样品进行超声处理。条件：输出功率15W，每次超声15秒，然后冰上孵育1分钟，重复3次。然后室温20000g离心15分钟以去除细胞碎片，并将上清转移到一个新的50ml离心管。
注意：离心在室温进行，防止尿素在低温离心中析出。
注意：超声探头功率不要过大，并要没入裂解样品中。在超声过程中可适当水平移动样品管，以保证超声处理均匀。
贴壁细胞样品：
1. 每组实验，培养达到70-80%的汇合率的1~2 ×108个细胞（约10个15cm直径的大培养皿对应的细胞数，需要能够产生10~20mg的可溶性蛋白）。
2. 小心去掉培养液，用5ml冷的PBS清洗细胞，然后去掉PBS，再重复清洗一次，去掉上清。然后在每个培养皿中加入1ml尿素裂解液（室温，不要预冷），用细胞刮子快速将细胞刮下并适当倾斜培养皿以汇集细胞，然后用1ml加样器将刮下的细胞悬液分别吸出并汇集到50ml离心管中，颠倒混匀几分钟以充分裂解细胞。注意：此处可以暂停并将收集的细胞裂解物冷冻保存在-80°C一个月。
3. 使用3mm超声探头的超声仪对样品进行超声处理。条件：输出功率15W，每次超声15秒，然后冰上孵育1分钟，重复3次。然后室温20000g离心15分钟以去除细胞碎片，并将上清转移到一个新的50ml离心管。
注意：离心在室温进行，防止尿素在低温离心中析出。
注意：超声探头功率不要过大，并要没入裂解样品中。在超声过程中可适当水平移动样品管，以保证超声处理均匀。
组织样品：
1. 取500mg左右的新鲜样品组织，液氮急冻后，快速称量并记录精确质量，转移到无菌的50ml离心管中，加入10ml 尿素裂解液。
2. 用组织匀浆仪（探头内带有刀片，如图所示）进行匀浆2-3次，直到组织全部破碎。
注意：匀浆时需室温操作，避免由于低温而导致的尿素析出
如果没有组织匀浆仪，建议将组织在研钵中加入液氮充分研碎，再加入10ml尿素裂解液，然后转移到50ml离心管中。
3. 用探头超声仪队样品进行超声，超声条件为：输出功率15w, 时间15s，3次。超声间隔为1min,并置于冰上。
4. 室温或者15°C, 20000g离心15min, 把上清转移到新的管子。
C. 蛋白浓度的测定（BCA 试剂盒法）
1. 根据BCA 试剂盒的方法先准备标准蛋白，标准蛋白试剂盒中有提供，用PBS 按指定的浓度稀释即可。
2. 按50:1的比例配置反应地物，充分混合均匀后加入到96well plate,每孔200ul。
3. 取25ul 标准蛋白和目的蛋白加入反应低物中，37°C, 20min。
注意：可以根据需要来设置2-3个复孔
4. 酶标仪读数据，并记录数据，并根据标准曲线计算样品浓度。
D. 蛋白的还原及烷基化
1. 根据测定的蛋白浓度，每个样品取相同质量的蛋白，并用尿素裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积。
2. 在以上蛋白溶液中加入1/278 体积的1.25M DTT（如10ml蛋白加入36ul的DTT），混匀，在55°C孵育30min。
3. 在冰上进行冷却直到达到室温。
注意：用手感觉时溶液不能太冷也不能太热。
4. 加入1/10体积的碘乙酰胺，充分混匀，室温避光放置15min。
E. 胰蛋白酶消化
1. 用20mM HEPES（pH8.0）4倍稀释烷基化处理后的蛋白溶液，即在D步骤得到的溶液中加入3倍体积的HEPES溶液。此时，溶液的中各个组分的终浓度为：尿素2M，20mM HEPES，pH8.0。如：10ml的蛋白裂解物，加入30ml的HEPES缓冲液。
2. 加入1/100样品体积的 1mg/ml 胰酶Trypsin-TPCK，并于室温消化过夜。消化的效果需要在第二天进行检测，一般通过SDS 凝胶电泳后的考马斯亮蓝染色即可判断，标准染色结果如下：
从左至右泳道: Marker；1:酶切前鼠肝；2: 酶切前鼠脑；3酶切后鼠肝；4. 酶切后鼠脑。
II．利用Sep-Pak®C18纯化柱对总肽段进行纯化
注意：肽段纯化在室温下进行，所用的Sep-Pak®C18纯化柱为0.7毫升容量，Waters公司生产，货号为WAT051910。
注意：Sep-Pak®C18纯化柱发挥反相（疏水性）固相萃取作用。肽和脂质可以结合于纯化柱中的色谱材料。大分子（如DNA、RNA和大多数蛋白质）以及亲水性的分子（如许多小的代谢物）可以通过这纯化柱从肽中分离出来。肽可以被40%乙腈洗脱，而脂类和蛋白质需用60%及以上的乙腈才会明显洗脱，从而实现同脂类和蛋白质的分离。
注意：一个Sep-Pak柱可以承载20毫克的蛋白酶解后肽段所进行的纯化，可在蛋白水解后立即进行。
试剂的准备
注意：配制此部分试剂可以用去离子水或同级别的水。三氟乙酸（trifluoroacetic acid ，TFA）请使用分析级试剂，乙腈（Acetonitrile，ACN）请使用色谱级试剂。以下所有的浓度为体积比浓度。
1. 20% 三氟乙酸（trifluoroaceticacid ，TFA）: 在40ml的去离子水中加入10mlTFA，最终体积为50ml。
2. 溶剂A (0.1%TFA): 取1.25ml 20%TFA 加入200ml去离子水，并定容至250ml。
3. 溶剂B (0.1%TFA，40%乙腈)：取20ml 乙腈和1.25ml 20%TFA加入10ml去离子水，并用去离子水定容到50ml。
4. 柱清洗液(0.1% TFA, 5%乙腈): 配制100ml柱清洗液，加入0.5ml20%的TFA, 50ml去离子水，再加入5ml乙腈，并用去离子水定容到100ml。
注意：有机溶剂挥发。这些少量的有机溶剂溶液应在使用前准备好，用完应尽可能保持管盖密闭好，防止有机成分迅速挥发。
B.对消化好的总肽段进行酸化处理
注意：在多肽过柱之前，还需要用TFA 对消化好的蛋白进行酸化，以便从消化后的蛋白混合物中去除脂肪酸。
1. 在消化好的蛋白样品中加入1/20 体积的20%TFA，使TFA终浓度为1%，用加样器取少量的样品滴于PH试纸上测PH 值（ pH值需小于3）。然后在冰上放置15min，会看到一些沉淀物的出现。
2. 室温，1780g 离心15min。小心将上清转移到一个新的50ml的离心管中，不要扰动沉淀物。
C.肽段纯化
1. 将 Sep-Pak®C18安装在去掉针头的10cc注射器上，并放置在可以支撑注射器的架子上，下面放一托盘接溶液（如下图所示）；
Sep-Pak®C18与注射器组装图
支撑注射器的架子及接溶液的托盘
2. 加入5ml的乙腈预润湿Sep-Pak®C18柱子，使乙腈在重力的作用下慢慢流出；
注意：每次加入溶液之后会在注射器与柱子小的入口出形成气泡，此时需要用上蛋白的超细（gel-load tip）枪头把气泡吸上来，不然液体就不能通过sep-Pak®C18 纯化柱流下。
3. 连续用1ml、3ml、6ml 的溶剂A（0.1%TFA）去清洗柱子。
4. 加入酸化的消化后多肽，使其缓慢流过Sep-Pak®C18柱。
注意：当多肽溶液多于注射器的承载量，可以分多次加入。
注意：如果液体流的特别慢，可以用与注射器配套的活塞轻轻按压下，使其能够流下，保证每次加液体的时候气泡能够吸出。
5. 连续用1ml、5ml、6ml 的溶剂A（0.1%TFA）去清洗。
6. 用2ml 柱清洗液（0.1% TFA, 5%乙腈）来清洗一次。
7. 将柱子放到一个新的15ml或者50ml离心管上，分别加入2ml溶剂B(0.1%TFA,40%乙腈)三次，将多肽洗脱下来。
8. 将洗脱液于-80°C 冰箱冷冻过夜。
9. 从-80°C冰箱取出洗脱好的多肽放入到冻干机（如下图）中冻干至少两天（或以上），以保证能够完全移除TFA ，冻干肽段在-80°C可以保存数月。
注意：如有必要，操作可以在此处暂停。一旦开始下一部分（修饰肽段的免疫沉淀）的操作，就不可中断。
注意：冻干肽段要使用标准冻干机，不要使用旋干机（如SPEED-VAC）。
注意：冷冻干燥时需要将盖子打开，然后盖上2层KimTech 纸，并用橡皮筋系紧，目的时为了避免样品在抽真空时被吸走，如下图：
III修饰肽段的免疫亲和纯化（IAP）
A. 试剂的准备
注意：所有溶液的配置都需要用质谱级别的水。TFA需要是最高级别，以下步骤中的百分比都是体积比。
PTMscan 试剂盒中提供的试剂：10xIAP 缓冲液，用去离子水将其稀释到1xIAP Buffer，1X IAP buffer 在4度可以储存一个月。
B. IAP操作步骤
1. 取一管微珠悬液，2000g离心30秒使微珠紧实地沉于管底，小心去除上清，然后加入1ml 1xPBS 重悬微珠；重复上述离心和洗涤微珠 4次，上清吸干净后加入40ul 1xPBS重悬（此步骤无须更换管子）。
2. 将冻干的多肽2000g、室温离心5min，确保所有多肽粉末汇集到管底；然后用1.4ml 1X IAP 缓冲液重悬，并将重悬混匀后的多肽溶液转移到一个新的1.7ml 的EP管里。
注意：冻干的多肽干粉在1X IAP 缓冲液中溶解后，用加样器取出10ul溶液滴到PH试纸上进行pH值的测定。一般情况下，pH 值约为7.0，或者不低于6.0；很少情况下溶液会呈现酸性（低于PH6.0），此时可以用1M Tris溶液去调整多肽溶液的pH 值，一般情况下加如5-10ul即可；
3. 4°C 10,000g 离心5min将不溶物离心到管底，离心后置于冰上；
4. 将第二步的上清吸出并加入到含有微珠的EP管中，直接把溶解好的多肽加入到微珠上面，稍微离心以避免气泡的产生。
5. 4°C于旋转摇床上孵育2h；由于需要旋转孵育，在孵育前请用封口膜将管子封好避免漏液。
6. 2000g离心30秒，用p-1000 微量移液器将上清转移到新EP管中并保存；此处的上清可以保存在-80°C，并可以继续用于其他类型的修饰肽段富集过程。
注意：为了在数量上保证微珠不会随着后续操作的明显损失，离心步骤需要按推荐的离心力进行，在吸取上清时可以不用吸得特别彻底，防止吸走微珠；并且后续所有的洗涤步骤都要在4°C进行。
7. 加入1ml 的 1X IAP缓冲液到微珠，上下颠倒混匀5次，离心30秒，移去上清，然后用p-1000 微移液器将上清吸走。
8. 重复步骤7一次，总共用1X IAP buffer洗两次。
注意：以下步骤中用到的水需要是HPLC级别的水。
9. 加入预冷的1ml HPLC级别的水到微珠中，上下颠倒混匀5次，离心30秒，移去上清；此处需要用p-1000微移液头将上清吸走。
10. 重复步骤9两次，总共用HPLC级别的水洗三次，洗的过程中最好摇晃混匀，保证有效的混匀；
注意：在洗涤的最后一步，用p-1000 微移液头移去上清之前，最好在离心5秒以便管壁上的液体能离下来，用蛋白上样的枪头（如图）把上清小心吸干净，此时用p-200微移液器。
11. 加入55ul 0.15% TFA 到微珠中，上下颠倒混匀并弹几次，不要涡旋，室温放置10min，并每隔2-3分钟弹几下混匀。
注意：此步将会把PTM的多肽洗脱下来，比较关键。
12. 2000g离心30秒，把离心下来的溶液转移到一个新的EP管里面。
13. 加入50ul0.15% TFA到微珠中，重复步骤12，把两次洗脱的纯化后多肽收集到一个EP管中。注意：此时要避免任何微珠混入到洗脱的多肽溶液当中，如发现有微珠混入，可以再次离心以沉淀微珠，然后将上清转移到新的EP管来解决。
IV．肽段浓缩与纯化并进行LC-MS分析
我们注意到，有许多浓缩肽的常规方法，例如使用商业化产品如ZipTip®或C18® tip已用于肽脱盐/浓度的优化。不管使用何种特定的方法，我们建议对选择的方法进行优化，须满足至少10ug肽的承载量。
C18 tips: ThermoScientific, part number SP201
ZipTip®: EMDMillipore, catalog number ZTC18S960
试剂的准备
注意：请使用Burdick andJackson水或其他达到HPLC级别的水来配制溶液。有机溶剂（如三氟乙酸，乙腈）都要使用最高级别的试剂。我们推荐的试剂来源如下：PierceTM Trifluoroacetic Acid (TFA), Sequencing grade (ThermoScientific, 28903) and PierceTM Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade (ThermoScientific, 51101)。
1. 溶液C（0.1% TFA, 50%乙腈）：将0.1ml的TFA加入到40ml HPLC水中，然后加入50ml乙腈，再用HPLC水定容到100ml。
2. 溶液D（0.1% TFA）：将0.1ml的TFA加入到50ml HPLC水中，再用HPLC水定容到100ml。
3. 溶液E（0.1% TFA, 40%乙腈）：将0.1ml的TFA加入到30ml HPLC水中，然后加入40ml乙腈，再用HPLC水定容到100ml。
注意：有机溶剂挥发。这些少量的有机溶剂溶液应在使用前准备好，用完应尽可能保持管盖密闭好，防止有机成分迅速挥发。
B．操作步骤
1. 首先将Stage tip置入一个EP管中，并竖直放在EP管架上，如下图
2. 在Stagetip加入50ul溶液C，1500g离心30秒，使溶液流过；然后再加入50ul溶液D并流过，并重复一次溶液D的流过。
3. 然后将上述III部分IP洗脱的肽溶液分两次（每次加入50ul）加入到Stage tip中，每次1500g离心30秒，使溶液流过。
4. 将55ul的溶液D加入到Stage tip 中，1500g离心30秒，使溶液流过。并再重复一次。
5. 将10ul的溶液E加入到Stage tip中，750g离心30秒，使溶液流过。并再重复一次。合并两次洗脱的多肽溶液（该管内的套管如下图所示）。
6. 将上述多肽溶液利用真空浓缩仪（SPEED-VAC）旋干，并用含5%乙腈和0.1%TFA的溶液溶解后，进入LC-MS的分析。
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