Xintian Shen 1 , Xuanxuan Zhang 2 , Shuwen Liu 2
1 School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; Department of Physiology, Huaihua Medical College, Huaihua 418000, China
2 School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
关键词： 血凝素（HA） 流感病毒 病毒
流感病毒引起的季节性流感甚至全球大流行给人民生命和社会经济造成了巨大的损失。截止目前，只有两类抗流感药物——M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂，用于防治流感病毒感染。不幸的是对其中一种甚至所有药物都有耐药性的病毒株不断出现。流感病毒包膜糖蛋白血凝素（HA）在病毒吸附、融合、进入过程中起着关键作用。因此，作为启动病毒生命周期的HA，是一个开发抗流感药物十分有前景的靶点。这里我们回顾了近来对HA蛋白折叠融合过程中的构象变化，以及靶向HA的流感进入抑制剂所做的研究，后者可为预防控制多重耐药的流感病毒引起的潜在大流行提供更多选择。
最近传染性呼吸道疾病的爆发，引起了全社会对潜在的全球疫情大爆发以极大关注，因为这将夺去上百万人的生命。大部分这类急性疾病爆发是由新型病毒引起，例如1997年高致病性禽流感H5N1、2003年蝙蝠源的冠状病毒SARS（SARS-CoV）、2009年猪源流感病毒pdmH1NI、2012与2013年新型SARS样冠状病毒hCoV-EMC、以及2013年禽源流感病毒H7N9（1）。值得注意的是，流感病毒非常频繁地侵袭人类，1918年西班牙流感全球范围内共造成至少2000万人死亡。野生鸟类是流感病毒的天然宿主，每年候鸟定期迁移到世界各地，这使得鸟类是空中跨区域传播最好的传播体。一株禽流感病毒株能通过变异以适应人类宿主环境，产生人传人的能力。相比目前的季节性流感病毒，一种出乎意料的适应人类的流感亚型或毒株更有可能引起流感大流行。
然而目前仅有两类抗病毒药物可用于临床治疗，分别靶向于流感病毒包膜上的M2离子通道和神经氨酸酶（也叫唾液酸酶）。M2离子通道抑制剂，包括金刚烷胺和金刚烷乙胺，能阻断病毒脱壳过程，该过程是病毒核糖核蛋白（vRNPs）释放进入细胞质的关键步骤。然而M2离子通道只存在于甲型流感病毒，因此对于甲、乙、丙三种流感病毒，金刚烷胺只对甲型流感有效。更重要的是现在流行的病毒大多对金刚烷胺耐药，因此不推荐对该药进行常规用药或无管制地使用（2）。第二类抗病毒药物是神经氨酸酶抑制剂（NAIs）。NAIs能抑制神经氨酸酶的酶活性，子代病毒从感染细胞释放时该酶起到关键作用。目前普遍使用的药物奥司他韦和扎那米韦都是在1999年就批准上市用于防治甲型和乙型急性流感。可静脉注射的神经氨酸酶抑制剂NAIs——帕拉米韦，在2009年被美国FDA审核批准用于紧急治疗对奥司他韦耐药的pdmH1N1感染，2010年日本批准其用于治疗甲型和乙型流感，2013年中国政府紧急批准其用于治疗新型流感病毒株H7N9引起的流感疫情。但是对神经氨酸酶抑制剂耐药的毒株不断涌现，尤其是对奥司他韦耐药者（3）。
为什么耐药流感毒株接连出现？因为流感病毒频繁变异使它们可以轻松适应大部分温和的选择压力。流感病毒拥有八段RNA基因组、低校对效率的RNA聚合酶，这些都使得合成病毒RNA的过程中会频繁发生错误。举例说，A/pdmH1N1/2009和A/pdmH7N9/2013，这两种新发流感病毒都是三个不同起源或亚型的甲型病毒的基因重组（抗原位移），同时积累了众多基因突变（抗原漂移）。以新发的A/pdmH7N9/2013病毒为例（1），虽然同为禽类来源，但是其与另一种H7N9病毒（KO14）仅有NA基因表达接近，即使如此，其NA基因也由于茎干区域删除了编码5个氨基酸的碱基而被缩短。其HA基因与临近地区（中国浙江）发现的一种H7N3病毒（ZJ12）相似，但是却拥有Q226L变异，这种变异可能使得它在人类中的传染性更强。所有内部的基因片段与禽类来源的H9N2病毒的都密切相关，尤其是与从北京燕雀体内分离出的病毒株关系密切。幸运的是，A/pdmH1N1/2009和A/pdmH7N9/2013这两种病毒大都对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦敏感。
正因为流感病毒变异如此频繁，几乎不可能生产一种及时有效的疫苗来预防对奥司他韦耐药的甲型流感病毒流行性爆发。使用抗流感药依然是在大规模流感爆发的开始阶段唯一的有效防治手段，以便为开发和大规模接种有效疫苗争取时间。
因此，寻求新型的抗流感药物就显得相当迫切。截止目前，流感病毒的生命周期过程已经被我们基本掌握，由此提供给我们多个治疗的靶点。在这其中，血凝素HA是一个极具吸引力的靶点，已发现的HAs有17个亚型，可进一步被细分为2组5个分支（图1）。值得注意的是2012年新近报道了一种来源于蝙蝠的流感病毒HA为新的H17亚型（4）。天然HA的多态性给合理的药物设计带来了巨大的困难，而且抗原位移和抗原漂移还会进一步增加HA的多样化（5,6）。这里我们描述了有关HA功能和结构的研究，以及这些结构信息是如何促进了以HA为靶点的新型抗流感病毒药物的合理设计，这些研究促进了靶向HA药物的研发。
图1 甲型流感病毒血凝素系统进化树（HAs）。使用了多序列比对工具（COBALT），图由Photoshop校正。进化树方法：fast minimum revolution；最大序列差异：0.85；距离：grinshin general protein。灰点代表进程节点，蓝点代表甲型流感病毒HA蛋白的17个亚型。
HA作为一种病毒包膜蛋白，是由甲型或乙型病毒第四段负链RNA基因组编码。该RNA片段最初编码的是血凝素的前体HA0，HA0经翻译后糖基化，在感染细胞的内质网内由分子伴侣折叠形成三聚体。随后经胞外或胞内的蛋白酶裂解转变为HA1和HA2（图2A,B），这是子代病毒成熟并获得传染性的关键过程（7）。低致病性流感病毒的HA0以保守序列Q/E-X-R作为酶切位点，该位点仅能被胞外组织限制性胰蛋白酶样蛋白酶识别（8）。而对高致病性的禽流感病毒（HPAI）来说，HA0酶切位点包含了多个碱性氨基酸残基（R-X-R/K-R），该位点可被细胞内广泛表达的蛋白酶切割（9）。
图2 HA的结构和变构。（A）HA的三聚体结构，三个单体分别为红、绿、蓝色。（B）吞饮泡内HA0的酶解以及低PH诱导的HA2重构。为了更清晰的展示重构的过程，这里仅展示了HA的一个单体。关键的环状和螺旋结构用不同的颜色标记，三种构象状态的名称保持不变：从左到右依次是裂解前、融合前、融合后。HA1亚基淡灰色显示。
HA0经过恰当的水解和折叠，三对HA1和HA2亚基形成融合三聚体HA（图2A），然后移位到宿主细胞膜。病毒装配之后，子代病毒通过胞吐作用外排，利用表达HA和NA的细胞膜作为其包膜。HA蛋白就像是插在病毒包膜表面的棒棒糖（图2B）。“棒棒糖”的球状头部主要由HA1的结构域构成，包括受体结合结构域，退化的酯酶结构域和抗原决定位。HA1受体结构域能识别宿主细胞膜糖蛋白末端的唾液酸（SAs），因此可以完成最初的病毒—细胞吸附过程，并诱导接下来的病毒入胞过程（11）。“棒棒糖”的杆状部主要由三聚体HA2亚基胞外区构成，HA2的N端前23个残基是融合功能肽（FP），HA1亚基的N、C端形成的疏水结构将其包裹其中（12）（图2B）。胞内体的酸化作用诱导了HA1的重排，而这导致FP由HA1形成的内部疏水结构中释放出来（13）。紧接着低PH环境诱导HA2不可逆重构，FP伸出并插入胞内体膜中，然后将病毒包膜与胞内体膜融合在一起（图2B）。融合使得核蛋白复合体能够释放到感染细胞的细胞质中，这就是病毒入胞的整个过程。
可能引发流感爆发的不是一般的季节性流感病毒，而是适应人类的禽流感病毒株。然而宿主嗜性从禽类到人的改变主要取决于受体结合的偏好，受体结合位点的结构类似于一个较浅的桶，由β桶状结构和α螺旋状结构构成，位于HA1的球状头部表面（残基116-261）。细胞膜表面糖蛋白末端的SAs是病毒吸附的天然受体，坐于两个芳香族氨基酸残基的顶部——“桶”底部的Y98和W153（12）。除了底部，“桶”上关键结合位点由保守残基构成，如190-螺旋围成结合口袋的顶端边缘，130环和220环分别位于该结合口袋的前侧沿及左侧（11）。总之HA受体结合位点主要由底部98、153位残基，130环的134-138位残基，190螺旋的183、190、194位残基和220环上224-228位残基构成。
禽流感病毒的HA优先与禽类消化道α-2,3糖苷键形式的末端SAs结合。因此禽流感病毒极少能跨过物种障碍感染人类，因为人类上呼吸道中只存在α-2,6糖苷键形式的末端SAs。换言之，要获得感染人类的能力，禽流感病毒必须通过抗原漂移和抗原移位的积累提高其结合α-2,6糖苷键形式的末端SAs的能力。
与前述受体结合位点一致，在130环、190螺旋或220环的相应受体结合位点发生的少数变异能够改变HA对不同形式SAs的亲和性，从而产生一株可以在人类间传播的禽流感病毒。近期的研究指出H1N1型禽流感病毒的HA1亚基的两个点突变（190螺旋的E190D 和220环的G225D）改变了受体结合的亲和性，从α-2,3-SAs转变为α-2,6-SAs，而这两个点突变也出现在1918 pdmH1N1和2009 pdmH1N1病毒，这样使得该两种病毒获得了在人人之间传播的能力且维持原有致病力（14,15）。有趣的是，这种点突变（E190D和G225D）并没有改变H5N1流感病毒受体结合的特异性（6）。2012年Imai等人得出一个惊人的发现，H5N1的HA1只需要四处变异（N158D，N224K，Q226L和T318I）就足以让这种高致病性病毒通过飞沫在雪貂之间传播（16,17）。值得注意的是，2013新型pdmH9N2病毒同样具有Q226L变异，这可能加强它在人类中的传染性（1）。
除了以上的基因变异会引起禽流感适应人类，流感病毒的8个基因组片段的基因重组也会导致其有效适应哺乳动物。通过反向遗传学方法，张（音译）等人系统性的创造了127种重组病毒，这些病毒由一株鸭源的H5N1与一株高度传染人的H1N1病毒重组而成，重组时保持H5N1鸭源病毒的HA基因不变（18）。传染性研究表明，H1N1病毒的聚合酶PA基因和非结构性蛋白NS基因均导致H5N1病毒能够在豚鼠间通过飞沫传播但不引起其死亡。更进一步的试验表明其它H1N1的基因也与哺乳动物间传染性增强有关，包括核蛋白（NP）、神经氨酸酶（MA）、基质（M）。因此在目前的农业环境下，H5N1禽流感病毒亚型确实可能通过重组来获得传染哺乳动物的能力。
HA介导了病毒的入胞过程，因此HA抑制剂可以阻断病毒生命周期的早期阶段，甚至能中和流感病毒。显然，尽管HA抑制剂可能无法阻止先前感染的细胞释放子代病毒，但是它能够立即阻止病毒的进一步感染。通过实施靶向HA的策略，已发现或设计有几类抗流感药物，诸如抗体、干扰HA相关因素的抑制剂、肽类、小分子甚至天然小分子类。
抗HA的单克隆抗体（mAbs）是一种重要的被动治疗流感的手段。抗体能结合HA的抗原决定位，因而在识别和清除入侵病毒的过程中处于核心地位。因此，流感病毒进化出了低保真聚合酶能够引发频繁的变异，并导致抗原位点出现不同的糖基化以避免被抗体识别中和（19,20）。由于病毒抗原移位和抗原漂变，大多数流感抗体和疫苗常常在短期内就失去作用。因此分离或是设计出具有广泛中和作用的单克隆抗体（bnmAbs）是目前一个前沿领域，这种抗体能识别HA上高度保守的位点。HA2茎部的高度保守区常常能引起交叉抗体反应。然而位于球部的HA1亚基的抗原表位突变频繁，这些抗原表位通常只能引起对特定毒株的免疫应答。而目前市面上的流感疫苗主要是靶向HA1头部的抗体，这也就是有效期限较短的原因。不过，HA1受体结合位点却极端保守，这是因为干扰病毒与受体结合的变异很可能会削弱病毒的粘附力和感染力。
事实上一些抗原表位与受体结合位点是重叠的，这些特殊的位点能够被天然抗体利用，通常人类bnmAbs就是这样一种抗体。抗体F045-092能同时中和Group 1和Group 2的流感病毒。F045-092竞争性抑制识别HA1抗原表位的抗体，尤其是130环上S136残基结合，但是与抗体C179（定位于HA2主干区域21）无竞争作用。另外两个bnmAbs，如C05和CH65，将其重链CDR3区插入受体结合位点（22,23），获得了对受体结合位点的高亲和力。F045-092和CH65这两种抗体均是分离自人类B细胞，表明这些抗体是针对受体结合位点天然生成的，因此通过疫苗接种策略可诱导这类抗体生成（21,23）。
单克隆抗体（mAbs），通过识别位于HA2近膜茎部区域的保守高效抗原表位，能广谱抑制不同的流感病毒毒株，并防止逃逸突变的出现。结合融合肽域（FP）的mAbs能抑制病毒融合，并在体外和体内抑制病毒的融合与复制（24,25）。最近胡（音译）等人从一个2009年H1N1流感疫苗接种者体内的记忆B细胞中提取了一套完整的单克隆抗体。这些中和单克隆抗体针对的保守线性表位FIEGGWTGMVDGWYGYHH）是HA2 FP结构域的一部分。除了靶向FP的这类抗体，mAb CR6261代表了另一类重要的靶向HA2的抗体。CR6261是由接种季节性流感疫苗的人体内分离得到（27）。CR6261表现出对H1、H2、H5、H6、H8和H9流感亚型广谱中和活性，保护小鼠免受致命的H1N1或H5N1的威胁。CR6261 Fab段分别与高致病H1N1和H5N1的HAs共结晶研究表明该抗体可以结合HA2茎部近膜区高度保守的α-helix（残基38-58），因此能稳定HA2，阻止病毒融合。但是CR6261类似抗体识别的保守抗原表位主要存在于HA2茎干区域的内表面，这不利于抗体的结合。
为了感染宿主细胞，子代病毒的HA0必须经酶解以形成有活性的成熟血凝素结构，细胞表面也必须要有足够受体SAs存在。因此，清除宿主受体或是抑制HA0的酶解都可以阻止病毒入胞。
DAS181是一种46 kDa的基因重组融合蛋白质，由上皮表面黏附结构域与粘性放线菌（Actinomyces viscosus）的唾液酸酶催化域融合而成（28）。在流感临床治疗领域，DSA181是唯一以宿主作为作用靶点的药物。通过酶解宿主呼吸道上皮细胞表面的病毒受体SAs，DAS181消除了病毒吸附的必要条件，继而阻止了病毒侵入靶细胞。DAS181可以裂解α-2,6-SA和α-2,3-SA，对多种实验室和临床分离的甲型和乙型病毒毒株均表现出了强效抑制作用，其中包括H5N1高致病性禽流感（HPAI），其体外EC50范围介于0.04-0.9 nM（28）。最近研究表明DAS181对对奥司他韦耐药的H1N1毒株也有抑制活性（29），这些发现进一步表明DAS181对新发及耐药流感毒株有广谱活性。
HA0酶解抑制剂抑制子代流感病毒HAs酶解导致其无法正确折叠，从而诱导其形成无功能的HA构象，阻止病毒入胞。一些丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如6-氨基己酸（8），奈莫司他（30），肺泡表面活性物质（一种肺泡表面活性脂蛋白复合体）（31），粘液蛋白酶抑制剂（32），在病毒感染的细胞模型及动物模型中，能抑制HA0的裂解（图3）。
图3 抑制HA前体H0裂解为功能性HA1和HA2亚基的流感病毒抑制剂的化学结构。
临床中曾应用的水解抑制剂有注射型牛胰蛋白酶抑制剂——蛋白酶肽（Trasylol bayer），曾用于治疗出血症状。但是遗憾的是，2008年的临床研究发现使用该类药物后会增加死亡率（33）。因此为了避免严重的不良反应，在人体内抗HA0水解的天然抑制剂可作为一个先导化合物以开发靶向HA的抗病毒药物。最近，有报道称MPSL/TMPRSS13通路能水解H5和H7亚基（34）。因此MPSL/TMPRSS13的抑制剂能抑制高致病性禽流感H5和H7的复制。
多肽类药物在近20年间发展迅速。作为小分子物质的多肽具有定位准确和毒性小的特点。值得注意的是，基于HA的多肽类疫苗用于预防流感前景良好。这里我们主要描述靶向HA的多肽类药物。
显然，SA受体类似物能竞争性抑制病毒HA与其受体结合，因而抑制病毒的吸附过程。利用噬菌体展示技术，Teruhiko等人识别出了数种可以与H1、H3型HAs的受体结合口袋结合的多肽，例如N-硬脂酰肽C17H35CO-ARLPRTMV-NH2和C17H35CO-ARLPR-NH2，这二者可以模仿SAs的结构和结合能力，抑制A/H1N1/Puerto Rico/8/34流感病毒的IC50分别为3.0和1.9 μM（35）。2006年一项研究发现一个20肽分子（EB）作为入胞抑制剂可以特异性的结合HA蛋白，在体内外抑制流感病毒，甚至在感染后也显示其广谱抗病毒活性（36）。不久之后，另一个比EB更小的多肽P1（CNDFRSKTC）也被发现具有和EB相似的抑制机制（37）。这些研究都表明与HA结合的多肽类分子是很有前景的抗病毒药。
相比HA结合多肽竞争性干扰病毒包膜上的HAs，屏蔽宿主细胞胞膜上的SAs是阻止病毒吸附的另一种策略。用N-硬脂酰肽分别烷基化c01和c03,生成C18-c01和C18-c03。烷基基团能够促进肽类分子聚集形成与SA受体多价结合。C18-c01和C18-c03能抑制A/PR/8/34流感病毒的IC50值分别为3.2和6.5 μM（38）。
上世纪90年代早期，研究发现HIV-1包膜的gp41 HR2域衍生的数种多肽能强效抑制HIV的融合与复制。其中，病毒入胞抑制剂T20（通用名：恩夫韦肽）作为新型抗HIV药物通过了FDA的上市审批（39）。这些发现启发了科学家去研究Ⅰ型包膜病毒（例如HIV）包膜衍生的可能的特异性多肽，针对诸如呼吸道合胞病毒RSV、麻疹病毒、SARS。
考虑到流感病毒也属于Ⅰ型包膜病毒，一些研究团队尝试去发现类似T20的抗流感病毒多肽。然而复制T20的成功并非易事，相比HIV gp41在细胞外中性pH的环境介导膜融合，HA在吞饮泡内介导膜融合是处于酸性环境。因此，要抑制吞饮泡中的融合过程，HA2的HR2区衍生的活性肽就必须穿过细胞膜，进入吞饮泡，并在酸性PH环境中保持稳定。直到现在，仅有一篇文献报道表明，与胆固醇共轭连接的HA2衍生肽能抑制膜融合和病毒感染过程（40）。他们推测胆固醇的部分通过将多肽插入靶细胞膜上，在病毒诱导的胞吞过程中使多肽伴随进入吞饮泡内。这一假设对于设计HA2衍生肽作为融合抑制剂有一定指导意义。
占据空间小的小分子更容易与HA蛋白表面的沟槽及靶穴相互作用。
既然SA是HA受体，那么SA类似物就可用于开发抗HA药。因为流感病毒在其表面通常含有350-400个三聚体HA（11），单价SA类似物难以竞争性抑制病毒HA与宿主细胞多价结合（图4）。因此需要二价、四价、甚至是多价的唾液酸来提高单价配体的抑制活性（41）。离体试验中多价唾液酸表现出了很强的活性（41）。目前公认的是，对α-2,6-SAs亲和力是病毒获得对人类感染的必要条件。因此多价的α-2,6-唾液酸寡糖能有效的抵御新型流行性流感病毒株。
图4 抑制病毒吸附的拟SAs抗病毒药物的化学结构。
在HA介导的膜融合过程中，酸性pH诱导HA2亚基发生不可逆变构、膜融合继而完成病毒入胞。理论上讲小分子融合抑制剂可以阻断流感病毒入胞。
阿比多尔是市面上唯一可购买到的流感病毒入胞抑制剂，仅有俄罗斯于1993年批准上市（图5）。阿比多尔还可以固定HA2并防止酸诱导HA2重构（42）。最近一项研究对阿比多尔耐药的突变流感病毒特性进行剖析证实了其抑制病毒的机制（43），当然这个分子抑制活性还有其他机制。
图5 能在融合PH下稳定HA2结构的小分子抗病毒药物的化学结构。
Wyeth-Ayerst的科学家发现了三个小分子化合物，CL-61917，CL-385319和CL62554，对H1和H2亚型禽流感有抑制活性，IC50达到微摩尔水平（44）（图5）。通过对CL系列化合物耐药流感病毒的突变序列分析，发现一个关键性残基突变，该位点位于临近FP的HA2茎部。通过分子对接分析，他们发现CL-61917可能结合FP附近的结合口袋，从而防止酸诱发的HA2重构。CL61917衍生出的CL-385319比前者在抑制H1和H2病毒感染方面更为有效。
我们研究小组进一步研究发现，CL-385319对H5N1流感病毒有抑制作用，靶点位于FP附近的HA2茎部，而不是受体结合域（45）。通过点突变分析和分子模拟技术，我们发现CL-385319通过“诱导-契合”的方式结合HA，这就意味着结合口袋的形成是在CL-385319与HA交互过程中逐渐形成的（46）。通过占据这一结构域，CL-385319在酸性pH下可以稳定HA2的融合前构象，抑制膜融合所必需的重排。我们进一步优化了CL-385319的结构，发现3氟-5-（三氟甲基）苯甲酰胺对抗H5N1活性非常关键。我们将CL-385319的吡咯环替换为噻吩环，衍生出化合物的1l抗流感活性提高两倍，这表明1l作为一个口服给药生物利用度较好的药物，未来开发前景良好（47）（图5）。
苯蒽醌和苯二酚可以预防酸诱导的HA2重构。最有前景的苯二氮卓类衍生物是TBHQ，它抑制病毒感染的IC50值在μM水平（48）（图5）。TBHQ耐药突变株表明TBHQ主要与HA2茎部区域相互作用。对HA结合TBHQ的共结晶分析表明，TBHQ可以在酸性pH下稳定HA2的融合前构象，其主要是通过结合HA三聚体中一个单体上的E97，另一个相邻单体上的R54、E57（49）。TBHQ能阻断H14亚型流感病毒的感染，对H5N1无效。通过分子对接虚拟筛选，发现两种化合物抗病毒活性较好，分别是S19（IC50 =0.8 μM）和C22（IC50 =8 μM）（50）。
日本盐野义制药实验室的研究人员发现提取自葡萄状耳霉的发酵培养基的次级代谢产物stachyflin及其衍生物具有较强的抑制融合的作用（51）（图 5）。Stachyflin能有效的预防H1亚型和H2亚型流感感染，IC50值达到微摩尔的水平。stachyflin通过阻断低pH诱导的HA2构象变化来阻断病毒融合过程。通过分析stachyflin耐药株的HA序列，研究者发现两个位于HA2亚基的突变位点，K51R和K121E（52）。这一结果进一步证实了stachyflin可以与HA2相互作用。该团队还设计并合成了stachyflin的衍生物，例如acetylstachyflin抗病毒活性和生物利用度更好（53）。
Bristol Myers Squibb的研究者发现了一种新型的融合抑制剂，BMY-27709，能够抑制A/WSN/33病毒的复制，IC50在3-8 μM，对各种H1亚型和H2亚型的病毒有效（54）（图5）。进一步对耐药突变株的基因序列分析提示这些化合物通过与HA2亚基的N端相互作用阻止HA介导的膜融合（55）。
Eli Lilly的研究者发现了罗汉松酸衍生物——LY-180299能作用于病毒复制的早期，对A/Kawasaki/86 H1N1有很强的抑制作用（56）（图5）。对LY-180299耐药毒株的HA基因序列分析发现，耐药突变位点分布于HA1亚基和HA2亚基相邻的界面上和HA2亚基靠近融合肽的位置。而且，耐药株发生膜融合的PH值比野生型高0.3-0.6个单位。这些数据都表明LY-180299能稳定HA中性状态的结构，阻止酸性PH诱导的HA融合性重构。
最近唐（音译）等发现靶向HA的苯磺酰胺系列化合物具有强效抗流感活性。这些化合物以水杨酰胺为骨架的HA抑制剂，是由cis-2-羟基-N-（5-羟基-1,3,3-三甲基环己基甲基）苯甲酰胺衍生而来（57）（图5）。先导化合物RO5464466及其2-氯代类似物RO5487624可以有效抑制A/Weiss/43（H1N1）流感病毒株的感染，IC50值分别为210 nM和86 nM。体内实验数据表明RO5487624有效的保护了小鼠，对抗致死剂量H1N1流感病毒的侵袭（57）。进一步的研究揭示，这些化合物通过结合HA、稳定融合前结构，来抑制病毒融合过程，并且具有明显的代谢稳定性，因此可以被开发成为新一代口服利用度高的HA抑制剂。
出人意料的是，氯喹作为一种廉价、使用广泛的抗疟药，在体外实验显示，其可能抑制数种病毒感染，其中包括流感病毒。然而Vigerust等人在动物实验中发现，该药并没有缓解临床症状，也没有减缓病毒的复制（58）。最近，一个随机双盲对照控制的临床试验也证明氯喹不能预防流感病毒的感染。不过北京大学医学部的研究人员发现在动物模型中，抗疟药氯喹对甲型H5N1的感染还是非常有效的（60）。
除了合成或是半合成小分子，一些天然分子对甲型流感病毒的感染也具有良好的抑制作用（图6）。比如说，从绿茶中分离的儿茶酚类如EGCG，就有一定的抗流感效果（61）。对这类酚类物质进一步的修饰可以得到一系列效果更好的抑制剂。值得注意的是，传统上接骨木类植物（西洋接骨木Sambucus nigra L）在西方国家一直被用于治疗流感和普通感冒。提取自接骨木的高活性的黄酮类化合物，例如5,7,3’,4’-tetra-O-methylquercetin，抑制H1N1的IC50值达到0.36 μM，相比之下其与奥司他韦的抗流感活性（Tamiflu®；0.32 μM）相当（62）。直接结合分析表明接骨木来源的黄酮类化合物能够结合H1N1病毒、阻断病毒入胞。除此之外，印度食品中广泛使用的香料和着色剂姜黄素也被证明是一种靶向HA病毒入胞抑制剂，EC50值接近0.47 μM（63）。对姜黄素的修饰也许能得到一系列新型的HA靶向抑制剂。另一个值得注意的小分子抑制剂是由穿心莲内酯衍生而来，如AL-1，其对甲型禽流感病毒（H9N2和H5N1）和人甲型H1N1流感病毒无论是体内还是体外实验均表现出十分显著的活性（64）。血凝抑制实验证实AL-1能够直接干扰病毒HA与细胞受体结合。因此，该类小分子是非常有前景的先导化合物，此外，2010年徐（音译）等人对中药 来源的天然抗流感单体作了系统性的回顾研究（65）。
图6 靶向HA的天然小分子化学结构。
血凝素作为流感病毒的主要包膜蛋白，介导病毒的吸附、膜融合过程，因而主导病毒的入胞。清晰的血凝素晶体结构提供了关于融合前、融合中、融合后过程中pH诱导的血凝素结构重排的详实信息，从而推动流感抑制剂的发展。虽然一系列靶向神经氨酸酶和M2离子通道的抗流感药物现已用于临床，但是由于耐药病毒的频繁出现，未来可能出现的多重耐药毒株更引起了业界高度的关注。所以有必要利用新的靶点开发新型抗流感药物。通过干扰受体结合、HA0裂解、酸性pH介导的HA2融合重构、病毒进入的相关因素等，不少化合物对血凝素介导的病毒入胞有阻断作用。虽然还没有成熟的分子模型用于发现或设计靶向HA1的小分子化合物，但是对HA2介导的融合过程的阐明为我们设计融合抑制提供了很大的帮助。除神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻断剂之外，未来的流感病毒进入抑制剂将为我们在防治由耐药株引起的严重呼吸道感染和可能的流感爆发流行提供更多选择。
此项工作由国家自然科学基金资金（No. 30772602, 81102792）支持。文中陈述源自文献作者的观点，我们为综述中遗漏的参考文献表示真挚的歉意。
声明：作者声明没有利益冲突。
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（翻译：许世杰；审校：申新田，刘叔文）
Cite this article as: Shen X, Zhang X, Liu S. Novel hemagglutinin-based influenza virus inhibitors. J Thorac Dis 2013;5(S2):S149-S159. doi: 10.3978/j.issn.2072-1439.2013.06.14
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