▋ 王利 1， 丘倚灵 1,2， 王建设 1,2
1 复旦大学附属儿科医院
2 复旦大学附属金山医院
肝脏具有解毒、代谢、合成糖原及白蛋白、分泌胆汁等重要功能，对于维持人体生理稳态具有重要作用。肝脏由不同细胞类型构成，包括上皮细胞（即肝细胞和胆管细胞）、Kupffer细胞、单核细胞、肝星状细胞、窦状内皮细胞、自然杀伤细胞、肝树突状细胞等。各种原因导致的肝脏疾病已成为全球最主要死亡原因之一。所以，深入了解肝细胞生理功能及相关疾病机制、提供有效的治疗方法，显得十分迫切。遗憾的是，经典研究模型存在以下限制：人原代肝细胞/胆管细胞难以获得，且体外不能长期培养及维持细胞结构与功能；细胞系、细胞株、小鼠等实验动物遗传代谢机制与人有较大差异，导致研究结果进行临床转化存在困难。因此亟需更加贴近人肝细胞的模型进行实验及治疗研究。新兴的类器官培养技术以其具有接近人体生理状态的细胞组成和类似的三维组织结构，成为近年来研究的热点。
1 肝类器官的培养过程
类器官是由多能干细胞或成体干细胞在体外培养而自身聚合形成的三维组织结构，可包含多种细胞类型，具有与原生器官类似的结构和功能。2013年，来自欧洲及日本的课题组分别报道了应用LGR5+干细胞及诱导多能干细胞 (iPSC)构建肝类器官的培养方案，开启了肝类器官的研究。肝类器官培养起始细胞来源较多，包括多能干细胞、原代肝脏组织等，亦有利用肝肿瘤细胞系/组织构建肝脏相关肿瘤类器官的报道。
利用各类干细胞进行肝类器官培养主要采用逐步诱导分化方案（以iPSC为例）：将iPSC逐步诱导至终末内胚层，再到前肠祖细胞，然后至成肝细胞阶段后通过加入成纤维细胞生长因子10、维甲酸、活化素A等向胆管细胞类器官分化，加入肝细胞生长因子、抑瘤素M等向肝细胞类器官分化。亦有研究团队提出在iPSC源性类器官经典培养基中加入25%MTeSR（主要是成纤维细胞生长因子2、维生素C等）以同时诱导其向内胚层和小部分中胚层分化，最终可实现肝细胞样细胞与胆管细胞样细胞的共分化，在培养的最后阶段加入胆固醇混合物促进肝-胆类器官的形成与成熟。
新鲜分离或通过组织保存液冻存的原代肝组织均可培养肝类器官，已成功建立小鼠、人、狗、猫肝类器官，具体的方案是：对肝组织的LGR5+细胞进行筛选，然后在肝类器官增殖培养基（主要包括内皮细胞生长因子、R-spondin、成纤维细胞生长因子10、肝细胞生长因子及烟酰胺）中进行培养。不断更新的研究中通过加入TGFβ受体抑制剂A8301以及CAMP信号通路激动剂FSK对培养条件进行改良，提高了类器官扩增效率。LGR5+细胞是一种具有双向潜能的肝干细胞，其本质是一种胆管细胞，类器官由该细胞生发，所以在增殖培养基中类器官形态更接近于胆管细胞类器官，进一步在肝类器官分化培养基中可以获得肝细胞类器官以及促进类器官更加成熟。不难看出整个培养过程分增殖和诱导分化两个阶段。在增殖阶段可直接进行传代培养，细胞接近肝祖细胞的状态，最终可实现鼠肝类器官大于1年的扩增，人肝类器官目前可实现3个月左右的扩增；在分化阶段可进一步促进类器官实现其功能。肝肿瘤细胞系/组织来源的肝类器官培养方法与原代组织源性肝类器官类似。所有肝类器官培养方案均强调基质胶（matrigel）为细胞生长提供三维空间的重要作用。
2 肝类器官主要类型
2.1 肝细胞类器官
由于缺乏有效的研究肝脏疾病的工具细胞，最初提出了将干细胞诱导分化为肝细胞样细胞的体外方案。但肝细胞样细胞仍不能满足实验需求，2013年，Takebe等利用iPSC源性的肝细胞样细胞与人脐静脉内皮细胞和人间充质干细胞在基质胶涂层板上共培养，产生了类似人肝芽组织的3D聚合物，这是最初iPSC源性肝细胞类器官的雏形。同一时期，Huch等利用原代肝脏组织同样培养出肝细胞类器官。
2.2 胆管细胞类器官
胆管细胞类器官的产生过程与肝细胞类器官类似，且比肝细胞类器官更易于培养、稳定性更高。胆管细胞类器官的典型形态是单层上皮样细胞围成的含有内腔的囊样或管样结构，类似于体内胆管的结构形态，可表达特异性胆管标志物，具有胆管的相关功能。另外，将肝外胆管细胞类器官种植在空心圆柱形可降解支架上，还可获得生物胆管并试用于肝外胆管疾病的替代治疗。
2.3 肝-胆类器官
肝脏是一个多细胞组成的具有复杂功能的器官，单细胞类器官并不能完全概括肝脏功能。2017年，Guan等首次利用iPSC实现了肝胆细胞共分化，产生了肝-胆类器官。2018年，Hu等利用原代肝组织培养出了具有小胆管结构的肝类器官。目前，尚无统一的肝-胆类器官培养方案，在不断改进与更新中，最近实现了从人诱导多能干细胞分化出包含肝细胞、胆管细胞、星状细胞以及Kupffer细胞的多细胞性肝类器官。包含多种细胞类型的肝类器官较最初的单细胞性肝类器官而言，更加接近肝脏的生理状态，结构更加稳定，功能亦更加成熟，具有诸如白蛋白分泌、药物代谢相关酶活性、糖原合成、低密度脂蛋白摄取等肝脏基本功能，还能够表达各极性膜面转运体。
多细胞肝类器官与单细胞肝类器官相比，可实现更贴近真实人类肝脏的代谢过程。另外，原代组织来源的肝类器官相较于多能干细胞来源的肝类器官，在长期培养过程中很少发生拷贝数变异或其他基因组结构变异，能够很好的反映并稳定维持取材个体的遗传特性，或许在类器官培养中会更具优势。
3 肝类器官的主要应用
3.1 疾病模型构建
类器官能够提供有关器官发育、稳态维持以及发病机制的基本信息，有望为疾病的诊断与治疗提供新的方法。迄今，已有不同种类肝脏疾病模型成功构建。
3.1.1 单基因遗传病
Sampaziotis等利用患者来源的iPSC成功构建了多囊性肝病和囊性纤维化相关性肝病的体外模型。Nantasanti等利用铜代谢缺陷狗(COMMD1-/-)的肝组织分化出肝细胞类器官，成功模拟了类似人肝豆状核变性中细胞内铜堆积的疾病表现，并证实存在铜排泄障碍；而通过载有COMMD1基因序列的慢病毒感染缺陷类器官后，铜代谢障碍表型得到纠正。Huch等利用Alagille综合征、α-抗胰蛋白酶缺陷病患者原代肝组织成功培养出疾病特异性类器官，对Alagille综合征类器官行KRT19染色，观察到胆管细胞缺乏且不能形成完整的胆管上皮，残存于类器官管腔的胆管细胞亦逐渐凋亡；在α-抗胰蛋白酶缺陷类器官内质网中观察到突变体蛋白的错误折叠与堆积，同时，ELISA检测证实了A1AT蛋白分泌减少，且类器官培养上清液抑制弹性蛋白酶活性的能力下降。
3.1.2 先天性肝脏疾病
Lorent等将鼠胆管细胞类器官暴露于与胆道闭锁发病相关的一种植物性毒性物质biliatresone中，观察到类器官管腔变窄、其单层上皮样结构完整性遭到破坏以及胆管细胞失去其顶-基底极性，进一步确定biliatresone可致胆道闭锁，也证实了类器官可用于构建胆道闭锁疾病模型并探索相关发病机制。
3.1.3 代谢性疾病
Ouchi等将肝类器官暴露于游离脂肪酸中，可以观察到脂质堆积于类器官，并且类器官脂肪变性的程度随着培养环境中游离脂肪酸的量增加而加重，还可观察到炎症反应及纤维化等表型；进一步在溶酶体酸性脂肪酶基因缺陷患者来源的类器官中观察到严重的脂肪性肝炎表现，加入法尼酯X受体激动剂FGF19后，其表型减轻。
3.1.4 传染感染性疾病
肝类器官可进行病毒感染，能够进行传染性肝脏疾病的构建。Baktash等利用HCV感染肝癌细胞来源的类器官，构建了HCV的疾病模型，通过与二维细胞培养相比，其感染效率更高。另外，该模型能够表达HCV定位依赖因子清道夫受体BI、CD81、表皮生长因子受体等，进一步进行了HCV定位于肝细胞的机制研究。同样，利用HCV感染iPSC源性的肝类器官构建了HCV性肝炎疾病模型。相较于二维细胞培养，运用肝类器官能够更好的反应病毒与宿主之间的相互作用。迄今，另有利用脑类器官构建寨卡病毒感染疾病模型并复现了相关表型以及进行了相关发病机制的探索，未来也有望利用肝类器官研究其他肝脏相关感染性疾病。
3.1.5 肝脏肿瘤类器官
2017年，Broutier等在肝类器官经典培养方案基础上，去除Respondin-1、Noggin和Wnt3a，添加地塞米松以及Rho激酶抑制剂，同时增加肝肿瘤组织消化时间，首次成功培养出肝细胞癌类器官、胆管细胞癌类器官和混合细胞癌类器官。随后各种肝脏肿瘤患者来源的类器官丰富着肿瘤类器官生物库。此外，结合CRISPR-Cas9基因编辑技术，可以将不同癌症基因的变异引入正常类器官，实现了从正常组织获得肿瘤类器官。最新有提出通过模拟肿瘤微环境以细胞共培养的方式产生肿瘤类器官，有望更好地应用于肿瘤免疫学及治疗反应研究。
3.2 药物筛选
一直以来，肝脏肿瘤的研究都缺乏能够完整重现原发肿瘤病理生理的体外模型，同时也限制了肿瘤治疗药物的研发。类器官技术的出现为肿瘤药物的筛选提供了良好的实验平台。利用原发性肝癌的肿瘤不同区域的活检组织进行类器官培养，所得到的肿瘤类器官不但可以重现来源肿瘤的组织结构及不同区域细胞的突变特征，体外长期扩增还可保持遗传稳定性，不改变肿瘤的病理类型。因此，肿瘤类器官已经成为临床前药物筛选模型，能够预测个体患者对疗法的反应。Broutier等揭示了不同原发性肝脏肿瘤的基因突变谱对治疗药物具有不同的敏感性，例如CTNNB1突变的肝细胞癌源性的类器官对wnt抑制剂LGK974耐受，但胆管细胞癌源性的类器官则对其敏感；此外，对肿瘤类器官进行药物筛选，还发现一种仅被批准用于肝细胞癌的治疗药物——索拉非尼，对于一些特定类型胆管细胞癌也有一定的治疗前景。因此，可以借助类器官模型，建立一个包含肿瘤类型、主要突变形式以及敏感或耐受药物的数据库，以为肿瘤患者快速确定合适的治疗方案，从而实现个性化治疗。Vlachogiannis等利用结肠癌、胃食管癌患者来源类器官预测靶向药物及化疗药物疗效，具有很高的敏感性与特异性。可见类器官亦是预测抗癌药物疗效的良好工具，可应用于肝脏肿瘤药物的疗效预测，具有很高的临床应用价值。另外，利用囊性纤维化相关性肝病患者来源的胆管细胞类器官，对该病治疗药物VX809和VX770进行疗效筛选，为实现个性化医疗提供了研究手段。
3.3 药物毒性测定
药物的肝毒性是限制其研发与应用的主要障碍之一。使用细胞系和动物模型进行药物毒理学研究通常不能准确预测其在人体内的不良反应。类器官具有人源性、遗传稳定性以及可实现高通量筛选等优势，能够为药物毒性测定提供更精确的方式。目前，美国食品与药品监督管理局已经开始尝试利用肝类器官进行食品添加剂、营养补充剂和化妆品的肝毒性测定。类器官将会是肝毒性药物筛选的良好工具。
3.4 细胞治疗
Takebe等在首次通过细胞共培养的方式获得iPSC源性类器官后，将其移植入药物诱导急性肝损伤小鼠体内，观察到类器官迅速填充小鼠肝脏并可提高小鼠的存活率及存活时间。同样地，将增殖阶段的人肝类器官移植入具有肝衰竭表现的Ⅰ型酪氨酸血症小鼠(Fah-/-)体内,类器官可在体内增殖并填充肝脏受损部分。此外，结合CRISPR-Cas9还可对类器官进行基因编辑，对于一些基因疾病可以实现精确的基因治疗。目前细胞治疗处于临床前实验阶段，尚需要更多的研究评估其安全性与有效性，以便能实现临床适用性。
3.5 组织重建类
器官培养的自发聚合有时会导致形成异常的组织结构，结合生物支架有利于避免这一问题。例如，将肝外胆管细胞类器官种植在不同形状的生物支架上可获得类似于胆囊壁及肝外胆管的生物工程组织，且成功重建了胆囊受损小鼠的胆囊壁以及修复了小鼠的肝外胆管损伤。另外，结合三维器官芯片系统有望以一种易于获得及可控的方式产生复杂的类器官模型，更好的服务于再生医学。
4 展望
类器官作为处于体内与体外实验交叉点的多功能模型，在疾病模型构建、药物筛选、细胞治疗等方面具有很好的应用前景。肝类器官在体外部分重现了肝脏发育的过程，可长期维持细胞极性及来源个体的遗传特性，移植入体内后可迅速发育为成熟肝细胞，具有二维细胞培养及动物模型无可比拟的优势。但目前肝类器官培养仍面临许多挑战，例如目前尚未对类器官培养所需凝胶系统matrigel进行成分上的定义，当引入培养体系时，可能会存在一些不可控的变异因素；肝类器官尚未包括肝脏中存在所有细胞类型，自然也无法完全实现成熟肝脏的功能，以及器官的血管化、免疫化及神经支配。另一方面，其它有关离体肝细胞支持培养的研究也取得了重大进展，例如应用含有5种小分子化合物的培养基培养新鲜离体的人肝细胞，能够长期维持肝细胞的极性结构、膜转运体表达和大部分成熟肝细胞功能。相信结合不断发展的前沿科学技术，类器官可以早日精确再现器官的生发过程，成为良好的实验工具和临床治疗模型。
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