首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心
肝硬化转化医学北京市重点实验室
国家消化系统疾病临床医学研究中心
肝纤维化是一种代偿性修复反应，各种病因的慢性肝脏疾病均可导致肝纤维化的发生，其中一部分患者最终可发展为肝硬化及肝癌。相关研究证实，肝纤维化/肝硬化的逆转与临床预后密切相关，很多肝病的新药临床研究将病理学明确的肝纤维化逆转作为主要的治疗终点。随着抗病毒时代的来临以及各种抗肝纤维化药物的不断研发，如何在治疗较早期判断或者预测肝纤维化/肝硬化的逆转，从而及早确定治疗方案以及预测患者预后，成为摆在肝病医生面前的一个新课题。
目前，判断肝纤维化/肝硬化逆转的金标准是肝活组织检查。但肝活组织检查存在有创性、取样误差、重复性差等局限，不适宜进行动态观察。血清学指标具有无创、可重复性好、可量化、取样误差小、易于重复检测等优点，可以减少患者肝活组织检查次数。因此，临床上急需应用简便的血清学指标来判断肝纤维化/肝硬化的逆转。在慢性肝病的发生发展及治疗过程中，肝细胞损伤与肝细胞再生、纤维形成与纤维降解等过程同时存在，而这些过程之间的博弈与平衡决定了肝纤维化的进展或逆转。与上述过程相关的血清学指标有助于判断肝纤维化/肝硬化的逆转。
1 肝损伤相关的血清学指标
在血清学指标中，临床应用最为广泛的是间接反映肝纤维化水平的、与肝损伤及肝功能相关的指标，如ALT、PLT、CHO、α-2巨球蛋白（α-2M）、肝珠蛋白（HPT）、载脂蛋白A1（ApoA1）、TBil等。由于单项血清学指标对肝纤维化的诊断效能有限，国内外学者构建了由多个综合指标构成的诊断模型。
1.1 FibroTest模型
2001年，基于339例HCV感染者的临床资料，法国MULTⅣIRC研究小组建立了首个用于肝纤维化诊断的模型FibroTest，这一模型包含α-2M、HPT、GGT、ApoA1和TBil五个参数。FibroTest对于显著性肝纤维化（METAVIR分期F≥2）具有很好的诊断价值，是目前验证最多、最广的一个模型。在慢性乙型肝炎（CHB）患者、酒精肝患者、HCV/HIV共感染患者及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中，FibroTest诊断显著性纤维化的受试者工作特征曲线下面积（AUC）分别为0.83、0.84、0.85和0.86。但此模型中α-2M和HPT两项指标在一般临床工作中不常检测，且其对轻微纤维化（F0~F1）的阳性预测值较低，限制了其临床应用。
除了可以用于诊断肝纤维化的严重程度，FibroTest与慢性丙型肝炎（CHC）治疗后的转归也密切相关。Poynard等观察了165例接受干扰素及利巴韦林治疗的CHC患者，结果显示，在有病毒学应答（SVR）的患者中，FibroTest持续下降，而在无SVR的患者中，FibroTest则基本维持不变。另一项研究也证实，在CHC患者中，基线FibroTest可以预测抗病毒治疗的SVR。但仅有SVR并不说明患者的组织学得到改善，很多患者在病毒复制被成功抑制后，有相当一部分患者肝纤维化程度仍未得到好转。Poynard等观察了FibroTest在抗病毒治疗后与肝纤维化程度变化的相关性，32例经肝穿刺病理诊断为肝硬化的CHC患者在经过24周抗病毒治疗后，17例患者肝硬化出现逆转（METAVIR评分与基线相比下降≥1），这部分患者FibroTest在治疗后显著降低；其余15例患者肝纤维化评分仍为F4，这部分患者FibroTest没有下降或者升高；结果提示FibroTest的变化可以反映肝纤维化程度的改变。在随后的一项HIV/HCV合并感染患者的临床研究中，FibroTest下降0.20被用于判断肝纤维化的好转。上述结论主要基于CHC患者的研究得出，在其他病因的慢性肝病中，FibroTest是否可反映肝纤维化的逆转还未得到验证。另外，上述研究中应用肝穿刺金标准的CHC患者例数较少，还需要在大样本队列中进一步验证。
1.2 APRI模型
2003年，Wai研究小组基于270例CHC患者的临床资料，建立了仅由AST与PLT组成的APRI模型。一项CHC（n=4266）的荟萃分析结果显示，APRI诊断显著性肝纤维化和肝硬化的AUC分别为0.76和0.82。APRI模型包含指标少、计算简单，是临床应用最为广泛的肝纤维化诊断模型之一。但与其他模型相比，其诊断准确率相对较低。国内一项研究纳入了937例经肝穿刺证实纤维化的CHB患者，APRI诊断显著纤维化的AUC为0.730；诊断进展型纤维化的APRI为0.710；其中，在HBeAg阴性患者中，诊断进展型纤维化的AUC仅为0.675。Kim等在一项大型CHB队列研究中发现，选择最优诊断界值1.27时，APRI诊断肝硬化的特异度和灵敏度分别为75%和48%，AUC仅为0.65；选择最优诊断界值0.72时，APRI诊断显著性肝纤维化的特异度和灵敏度分别为54%和76%，AUC仅为0.69；提示APRI对CHB肝纤维化诊断能力较差。
Li等观察了104例CHB患者抗病毒治疗后APRI的动态变化，在经过3年恩替卡韦治疗后，所有患者的APRI均显著下降；其中，肝硬化患者在治疗后APRI从0.80降至0.25，显著性纤维化患者在治疗后APRI从0.54降至0.24，轻度纤维化患者在治疗后APRI从0.35降至0.23。另一项前瞻性的临床研究纳入了50例HBeAg阴性CHB患者，在经过2年核苷类似物抗病毒治疗后，APRI在治疗后（0.36±0.28）与基线（0.97±1.73）相比无显著差异。Kim等也观察了CHB患者在抗病毒治疗前后APRI的动态变化及应用价值，结果显示，APRI在经过240周替诺福韦治疗后显著下降；其中，87.6%（261/298）的患者APRI低于0.5（用于排除显著性纤维化的诊断界值），而这部分患者组织学被诊断为进展型肝纤维化；在24例治疗后组织学诊断为肝硬化的患者（Ishak=6），仅有1例患者APRI＞2.0（用于诊断进展型肝纤维化及肝硬化的界值），其余23例患者APRI均低于2.0；APRI的变化与肝纤维化的逆转（Ishak变化＜0，n=155）、肝纤维化程度不变（Ishak变化=0，n=134）及肝纤维化进展（Ishak变化＞0，n=9）均无相关性。上述研究结果提示，无论治疗后肝纤维化程度是否发生逆转，APRI均可降至较低水平，APRI变化不能预测肝纤维化组织学的逆转。
1.3 FIB-4模型
2006年，Sterling研究小组基于832例HCV/HIV共感染者的临床资料，建立了由年龄、ALT、AST和PLT组成的FIB-4模型。在CHC患者中，FIB-4诊断严重肝纤维化（F3~F4）的AUC为0.85；FIB-4＜1.45排除严重肝纤维化的阴性预测值为94.7%，灵敏度为74.3%；FIB-4＞3.25诊断严重肝纤维化（F3~F4）的阳性预测值为82.1%，灵敏度为98.2%；采用这一诊断区间，FIB-4与肝穿刺的符合率可达到72.8%。在CHB患者中，选择最优诊断界值1.43时，FIB-4诊断肝硬化的特异度和灵敏度分别为71%和67%，AUC为0.74；选择最优诊断界值0.97时，FIB-4诊断显著性肝纤维化的特异度和灵敏度分别为62%和78%，AUC为0.75。在HBeAg阴性患者中，FIB-4诊断进展型纤维化的AUC仅为0.668。荟萃分析结果显示，FIB-4在CHB患者中诊断肝硬化时效能优于APRI。与APRI相似，FIB-4模型包含指标少、计算简单，是临床应用最为广泛的肝纤维化诊断模型之一。
在经过3年恩替卡韦治疗后，CHB患者的FIB-4显著降低；其中，肝硬化患者在治疗后FIB-4从1.27降至0.81，显著性纤维化患者在治疗后FIB-4从1.12降至0.78，而在轻度纤维化患者FIB-4无明显变化。在Kim等的研究中，FIB-4的研究结果与APRI类似，在经过240周替诺福韦治疗后FIB-4显著下降；但是，在35例治疗后组织学诊断为进展型肝纤维化及肝硬化的患者（Ishak=4~6）中，仅有5例患者的FIB-4＞3.25（用于诊断进展型肝纤维化及肝硬化的界值），其余30例患者FIB-4均低于3.25；同样，FIB-4的变化与肝纤维化的逆转、肝纤维化程度不变及肝纤维化进展均无相关性。APRI和FIB-4主要由肝损伤相关的血清学标志物组成，上述研究结果提示，两者在治疗后的显著降低主要反映的是肝损伤的改善，而并非肝纤维化组织学的逆转。国内一项最新的研究结果也同样显示，包括APRI和FIB-4在内的多种肝纤维化无创诊断模型对于治疗后肝纤维化的进展或逆转不具备诊断价值。
1.4 Forns指数模型
2002年，西班牙的Forns研究小组基于476例HCV感染者的临床资料建立了由年龄、胆固醇、GGT和PLT组成的模型。Forns指数诊断CHC患者显著性肝纤维化的AUC为0.86，Forns＜4.21排除显著性肝纤维化阴性预测值为96%，Forns＞6.9诊断显著性肝纤维化的阳性预测值为79%。在CHB患者的研究中，Forns诊断显著性肝纤维化的AUC仅为0.68。2018年最新的一项研究纳入了157例经肝穿刺证实的NAFLD患者，Forns诊断轻微肝纤维化（Brunt评分0~1）的AUC为0.706，诊断进展型肝纤维化（Brunt评分3-4）的AUC为0.681，诊断肝硬化的AUC为0.892。
一项研究纳入了38例对干扰素治疗产生持续应答的CHC肝硬化患者，61%的患者在抗病毒治疗后肝硬化获得逆转；研究观察了包括APRI、FIB-4和Forns在内的10种肝纤维化血清学诊断模型在抗病毒治疗前后的变化，结果显示，上述指标在治疗后均显著下降，但逆转组与非逆转组之间无明显差异。上述结果说明，Forns值变化不能反映CHC患者治疗后肝纤维化的变化。在Stasia等最近的一项研究中，HBeAg阴性CHB患者在经过2年核苷类似物抗病毒治疗后，APRI及FIB-4水平与基线无显著差异，而Forns值在治疗后显著下降。Forns值变化与CHB患者治疗后肝纤维化改变的相关性目前还未见研究。
2 纤维生成与降解相关血清学指标
除了可以间接反映肝纤维化水平的血清学指标，反映细胞外基质生成与降解的血清学指标被称为肝纤维化的直接血清学标志物。临床上有较多应用的包括透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）等，以及由上述指标联合建立的诊断模型，如ELF等。近几年，越来越多的研究关注于胶原合成及降解过程中产生的新肽段（新抗原决定簇，neo-epitope），这些新抗原决定簇可以反映胶原合成及降解的动态过程。
2.1 HA与PⅢP
HA与PⅢP是研究最多且应用最为广泛的肝纤维化直接标志物之一。在CHC患者中，HA和PⅢP区分轻度纤维化与显著性肝纤维化的AUC分别为0.864和0.691；当HA ＜60 μg/L时排除肝硬化或显著性肝纤维化的阴性预测值可达到99%及93%。在酒精性肝病中，HA及PⅢP区分正常或单纯脂肪变与肝纤维化的AUC分别为0.913及0.867。在抗病毒治疗后，CHB患者血清HA及PⅢP水平均显著降低，由PⅢP与PLT构成的PP诊断模型在抗病毒治疗后，对肝纤维化的诊断能力降低，不能反映治疗后肝纤维化程度的变化。在接受干扰素及利巴韦林治疗的CHC患者中，有SVR的患者与无SVR的患者血清HA的变化无显著差异。
HA在正常肝组织中以大分子（大于1 MDa）的形式存在，在维持组织稳态及抗炎过程中发挥重要作用。在病理损伤时，大分子的HA被透明质酸酶降解为小分子HA，通过下游的Toll样受体4等信号通路发挥促炎及促血管形成的作用。在接下来的研究中，如果能分别检测大分子量及小分子量的HA，有可能更好的反映纤维形成的动态变化。另外，之前的研究中，血清PⅢP的测定方法检测的除了新形成的Ⅲ型胶原，还包括已经存在的Ⅲ型胶原，如能特异性检测新形成的胶原，有助于更准确地反映肝纤维化动态变化。
2.2 ELF模型
2004年，欧洲肝纤维化小组基于1021例包含多种病因的慢性肝病患者建立了ELF模型，这一模型包括年龄、HA、PⅢP及金属蛋白酶组织抑制因子四种指标。在CHC、NAFLD和酒精性肝病患者中，ELF诊断中重度肝纤维化的AUC分别为0.773、0.870和0.944，具有建模范围广，使用不受病因限制的优点。
Tanwar等观察了ELF在抗病毒治疗后的变化及其与肝纤维化逆转的关系，研究共纳入70例对标准抗病毒治疗无应答的CHC患者，给予24个月长效干扰素单独治疗或联合水飞蓟素治疗，分别在基线、治疗12、24个月进行肝穿刺。在治疗结束时，21例患者Ishak评分下降，24例患者Ishak评分升高；27例患者ELF值降低，43例患者ELF值升高；治疗12个月ELF较基线变化值与治疗结束ELF和Ishak较基线变化值密切相关；研究者建立了由基线ELF、Ishak评分和治疗12个月ELF较基线变化值组成的模型，这一模型可预测治疗结束时的肝纤维化程度（AUC为0.88~0.92）、肝纤维化的逆转（AUC为0.81~0.84）及进展（AUC为0.86~0.91）。但在另一项研究中，CHC肝硬化患者在干扰素治疗后，ELF较基线值显著下降，而肝硬化逆转组与非逆转组之间无明显差异。
2.3 与细胞外基质（ECM）重塑相关的新抗原决定簇
在肝纤维化发生发展及治疗过程中，ECM的重塑过程也在持续进行，这其中既包括ECM的合成也包括ECM的降解。研究结果显示，肝脏胶原合成速率与肝纤维化程度密切相关，了解新生ECM及降解ECM的动态变化，有助于判断肝纤维化的进展或逆转。胶原在合成之初以大分子的前胶原形式存在，在氨基端和羧基端均带有一个肽段，随后在特异性蛋白酶的作用下，两端的肽段被酶切后成为成熟的胶原分子；在胶原降解过程中，基质金属蛋白酶可特异性酶切胶原，生成新的肽段；这些肽段可反映胶原合成及降解的过程。C1M、C3M、C4M和C6M分别是Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原和Ⅵ型胶原在降解过程中被基质金属蛋白酶特异性酶切产生的新抗原决定簇，可以反映胶原的降解过程。Pro-C3、P4NP7S和PRO-C5分别是Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原、V型胶原在形成过程中，被特异性蛋白酶切割后产生的新抗原决定簇，可以反映胶原的合成过程。
Nielsen等的研究发现，CHB与CHC患者血浆中胶原合成与降解相关的抗原决定簇的组成有一定的差异。其中，Pro-C3、C3M和C4M与CHB、CHC患者的肝组织炎症及纤维化水平均具有相关性；而C6M与P4NP7S仅与CHC患者的肝组织炎症及纤维化水平相关。提示不同病因引起的细胞外基质的重塑过程不尽相同。在NAFLD患者，Pro-C3与血小板计数等指标组成的模型诊断进展期肝纤维化的AUC在建模组为0.86，在验证组为0.87，优于APRI、FIB-4等模型。
Karsdal等观察了上述抗原决定簇与肝纤维化转归的相关性，研究纳入了52例应用安慰剂治疗的CHC患者，随访52周后行第2次肝穿刺，部分患者肝纤维化进展，而部分患者肝纤维化出现了自发逆转。结果显示低水平的Pro-C5与患者肝纤维化的自发逆转相关，识别患者是否发生自发逆转的AUC为0.78，阳性预测值和阴性预测值分别为60%和95.7%；Pro-C3和C6M组成的模型可以识别肝纤维化进展型的患者，AUC为0.91，阳性预测值和阴性预测值分别为75%和88.6%。在另一项CHC患者Ⅱ期随机双盲对照研究中，经过12个月过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激动剂法格列酮治疗后，Ishak评分下降、不变及升高的患者之间Pro-C3的水平存在显著差异。与Ishak评分不变的患者相比，评分升高的患者血清中Pro-C3水平显著升高。多因素分析显示，仅基线Pro-C3与肝纤维化的进展独立相关。根据基线Pro-C3的水平将患者分为2组，Pro-C3＞20.2 ng/ml的患者通常伴有较重的脂肪变、纤维化及较高的FibroTest检测值，在这一组患者中，给予安慰剂治疗的患者在52周Ishak评分较基线增加0.6，给予法格列酮治疗的患者Ishak评分较基线仅增加0.1；而在Pro-C3＜20.2 ng/ml的患者中，治疗组与安慰剂组无显著差异；结果提示Pro-C3高水平组对治疗有更好的应答。上述研究结果提示，Pro-C3可以预测CHC患者肝纤维化的进展情况、监测患者疾病进程，有助于选择适于进行抗肝纤维化治疗的患者。上述新抗原决定簇能否反映其他病因肝纤维化的变化仍需要进一步研究。
3 免疫相关血清学指标等
免疫反应在肝纤维化的发生发展及逆转过程中发挥重要作用，检测免疫相关的血清学指标有助于判断肝纤维化的转归。在肝组织中，多种非实质细胞参与了免疫调控过程，包括巨噬细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞、树突状细胞和淋巴细胞等；其中，研究最为深入的是巨噬细胞。在肝损伤的早期，肝脏Kupffer细胞活化并释放趋化因子募集单核巨噬细胞进入肝组织，这些外来的巨噬细胞主要分泌干扰素γ、IL-1β、TNFα等促炎因子；此时，Kupffer细胞及趋化而来的巨噬细胞发挥M1型功能，促进肝纤维化的发生。巨噬细胞在损伤肝组织中吞噬细胞碎片后基质金属蛋白酶13表达增加，降解细胞外基质的功能增强。在纤维化逆转过程中，位于纤维隔中的巨噬细胞高表达基质金属蛋白酶13，这群巨噬细胞的表型及功能类似于M2型巨噬细胞，主要分泌IL-10等抗炎因子，促进肝纤维化的降解。将CHC患者根据肝纤维化程度分为轻度纤维化组（F1~F2）和严重纤维化组（F3~F4），严重纤维化组的患者血清中TNFα和干扰素γ水平高于轻度纤维化组，而血清IL-10则低于轻度纤维化组；上述结果说明，血清中的促纤维化及抗纤维化因子的水平有可能提示组织学上纤维化程度的变化。
N-连接的糖基化是IgG主要的翻译后修饰形式，IgG上的多糖对其发挥正常的生物学功能至关重要。其中主要的多糖包括半乳糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺等。有研究显示，与健康人相比，慢性乙型肝炎患者血清中IgG-Fc糖基化异常，特别是半乳糖缺乏。岩藻糖基化和完全半乳糖基化与肝组织坏死炎症评分及纤维化评分相关，在抗病毒治疗后，IgG-Fc糖基化异常可以被逆转。
反复的肝损伤导致肝组织再生能力不足或者受到抑制，此时肝纤维化过程开始启动。人和小鼠血清中存在天然的IgM抗体，在肝移植受者血清中天然IgM抗体水平显著降低，而在移植肝中大量表达，提示血清中的IgM可能到达肝脏促进肝组织的再生。血清中天然IgM抗体的升高有可能提示肝脏再生能力的恢复。
4 其他血清学指标
在细胞凋亡、坏死和活化时，DNA可释放至血中成为游离DNA。血浆DNA甲基化可以反映肝纤维化水平，在26例NAFLD肝纤维化患者中，血浆PPARγ基因启动子甲基化水平可以反映肝纤维化程度，其区分轻度纤维化和进展型纤维化的AUC为0.91，阳性预测值及阴性预测值分别为91%和87%，特异性高达93%。在13例酒精性肝病肝硬化患者血浆中，PPARγ基因启动子甲基化水平也显著升高。近几年又出现了一些新的肝纤维化血清学诊断指标，如Mac-2结合蛋白聚糖异构体、壳多糖酶样蛋白YKL-40等。其中，Mac-2结合蛋白聚糖异构体对肝纤维化的诊断价值在多种病因引起的肝纤维化队列中得到了验证。另外，血浆外泌体中含有的非编码RNA及蛋白等成分也有可能成为新的血清学标志物。
5 结语
无创诊断方法具有安全、重复性好等优点，适于监测肝纤维化的进展和治疗效果。但现有的血清学评价指标主要来自于基线患者的数据，在抗病毒或抗纤维化治疗后，大多数指标或模型的诊断能力下降，不能反映肝组织学的改变。虽然有研究证实部分血清学指标或模型可以反映治疗前后肝纤维化程度的变化，有助于判断或预测肝纤维化/肝硬化的逆转，但样本例数较少。目前，仍没有证据确凿的用于评价肝纤维化/肝硬化逆转的血清学诊断指标。
高质量的肝穿刺标本、肝穿刺金标准的进一步优、设计严谨的大样本队列是准确评价肝纤维化和肝硬化逆转的先决条件。肝纤维化逆转机制的深入研究也有助于发现新的血清学评价指标。由于肝纤维化的逆转是一个复杂的过程，包括了损伤修复、肝细胞再生、纤维降解等多个动态过程，多指标联合预测模型是未来研究的方向。另外，不同病因肝纤维化逆转的评价指标可能具有一定的特殊性。
引证本文：刘天会. 肝纤维化和肝硬化逆转的血清学评价[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(4): 714-719.
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