目前已上市治疗慢性乙型肝炎的药物主要包括2种干扰素（IFNs）与5种核苷和核苷酸类药物（NAs）。
IFN是最早用于抗HBV的药物，目前在临床上被广泛用于治疗慢性肝炎和肝癌，但由于不良反应较多而使药物耐受性欠佳。IFN的不良反应是导致治疗中断的重要原因。随后出现的NAs在体内通过磷酸化，形成有抗病毒活性的、能与核苷酸竞争性渗入病毒DNA链三磷酸核苷类似物，抑制HBV DNA复制并抑制DNA多聚酶和逆转录酶活性从而达到抗病毒的作用。虽然NAs在临床上被广泛应用，但无法彻底清除肝细胞中的cccDNA，一旦停药，病情会进一步恶化；若想达到完全清除HBV的目的，则需要患者接受长期抗病毒治疗，随之而来的就是耐药性的产生和用药安全性问题。
依据目前已有的治疗方案，无论是PEG-IFN或NAs的单药治疗，亦或是二者的联合治疗，仅仅会使很少一部分患者出现HBsAg消失，而这只被认为是功能性治愈，并非病毒的清除。同时，HBV感染机体后的转归是宿主的免疫系统与HBV感染的肝细胞共同作用的结果。因此，针对HBV与肝细胞作用的不同靶点以及宿主免疫调节等层面，进一步研发低毒、高效的抗HBV新药，整合几种治疗策略实现对HBV更好的控制甚至是达到治愈的目标，具有重要理论价值和现实意义。
HBsAg消失伴或不伴有抗-HBs产生是急性HBV感染治愈或慢性HBV感染抗病毒治疗停药的有效终点，即所谓的“功能性治愈”。在这种情况下，通常认为血清中无法检测到HBV复制，同时，机体对肝细胞中持续存在的cccDNA实现了持久的免疫学控制。由于HDV的复制有赖于HBsAg的存在，因此，功能性治愈使HBsAg消失足以清除HDV的感染。在某些特定的临床背景下（如使用免疫抑制剂），“临床治愈”或“功能性治愈”仍有可能出现静止的cccDNA重新进入转录状态的风险。与此相区别的是“根除性治愈”，意味着包括HBV感染肝细胞核内的病毒复制模板cccDNA在内的所有HBV彻底从机体清除，这也是抗HBV新药研发追求的目标。
主要针对的靶点包括以下几个环节：HBV入胞、HBV cccDNA的产生及加工、病毒复制以及病毒蛋白的表达。
Myrcludex-B2012年，胆汁酸盐泵牛磺胆酸钠协同转运多肽（NTCP）作为HBV与HDV的共同入胞受体被发现。合成脂肽Myrcludex-B可与HBV-preS1竞争结合肝细胞表面的NTCP，从而阻断HBV入侵肝细胞。该药可被用于阻断HBV暴露后感染的蔓延、慢性HBV感染者接受肝移植后再感染以及HBV阳性的母亲对新生儿的传播。2012年，德国Maxwell Biotech 旗下的投资组合公司开始研发Myrcludex-B。Ⅰ期临床试验研究显示Myrcludex-B具有良好的耐受性。Ⅱa期阶段试验对40例慢性HBV感染者采用不同 Myrcludex-B 剂量进行疗效观察，结果提示该药对HBV DNA的控制存在剂量依赖性，即75%接受10 mg Myrcludex-B的患者在12周内 log10 HBV DNA降幅大于1，而其余剂量试验组（17%受试者）则很少出现。无论是24周还是48周，Myrcludex-B的安全性、耐受性都很好。即将开始Ⅱb期临床试验研究。
以HBV治愈为目标的靶向cccDNA治疗旨在阻止cccDNA的合成，消除已有的cccDNA或停止cccDNA的转录。尽管迄今为止，cccDNA的生物起源过程尚未完全清楚，但在理论上，控制cccDNA是可以实现的，包括拆解病毒衣壳，抑制rcDNA进入细胞核，阻止rcDNA转变为cccDNA，消除机体已有的cccDNA，停止cccDNA的转录以及抑制病毒/肝细胞有利于cccDNA稳定或形成的其他因素。
rcDNA 需要经多个步骤转变为cccDNA，极有可能与宿主的DNA修复过程相互作用。TDP2是一种DNA修复酶，可以在鸭HBV rcDNA 释放病毒聚合酶的过程中特异性裂解酪氨酸-DNA连接，而这一过程是rcDNA转变为cccDNA的关键步骤。如果破坏人类细胞中的TDP2，将会显著减少rcDNA向cccDNA的转变。该研究首次确认了一个关联cccDNA生物学起源的细胞因素。近期的一项研究则显示，尽管TDP2在体外可以裂解酪胺酰负链DNA连接，但将人类肝癌细胞中的TDP2基因敲除后，并不能阻断cccDNA的形成，提示TDP2对cccDNA的形成似乎不是绝对必需的，这也为将TDP2作为去除cccDNA潜在的靶点带来一些问题。
在众多细菌的基因组中发现了规律间隔的短回文重复序列（CRISPR) 及其相关联的蛋白基因（Cas)。后续研究发现，这些CRISPR与很多病毒或者质粒的DNA序列互补，可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制。近期的一些研究试图针对HBV基因组的保守区域设计CRISPR，结果显示，CRISPR/Cas9不仅可以抑制病毒基因的表达与复制，而且可以清除细胞内的大量cccDNA。但如何使CRISPR/Cas9有效进入肝脏内仍然是有待解决的问题。
依据HepDE19细胞系，通过对具有85 000种小分子文库的筛选，发现有2种双取代的磺胺类（DSS）化合物能够抑制cccDNA的合成。与NAs相比较，DSS化合物主要是阻断HBV rcDNA向cccDNA的转化，而非抑制rcDNA的产生，即可降低cccDNA的水平，也可减少其前体去蛋白化的rcDNA的产生。
在IFNα治疗中，有学者发现细胞内脱氨酶APOBEC3A可以介导cccDNA非细胞毒性的降解。与IFNα相比较而言，来自同一脱氨酶家族的APOBEC3B可以通过活化LTβR发挥更强烈的cccDNA去氨基及促其降解的作用。低剂量的LTβR激动剂既无任何毒性也不会对基因组DNA进行任何修改。LTβR激动剂不仅是潜在的靶向治疗策略，也可能在一定程度上提供了细胞因子依赖性非细胞病变方式清除cccDNA新机制。
可以说，目前所能获得的大部分靶向cccDNA的研究结果均来自细胞模型或将HBV DNA及CRISPR/Cas表达质粒通过水流动力学的方法进行小鼠体内注射，在小鼠肝脏内形成共转染的模式，以此来模拟急性HBV感染，而非慢性HBV感染模式。而且，并非所有的细胞模型都可进行对cccDNA影响的正确评估。尽管上述研究展现了良好的前景，但在发展为临床治疗药物之前，某些问题仍值得关注，如在慢性HBV感染的动物模型中有效性的证据；对非靶向器官的影响；耐药病毒的选择评估；被整合的潜在靶向病毒序列以及对病毒致病性和宿主基因组稳定性的影响等。
HBV衣壳对于HBV基因组包装、逆转录、胞内运输以及HBV基因组被包被后再次进入细胞核都是必不可少的。随着HBcAg晶体结构以及核心二聚体组装过程的明确，有几种靶向HBcAg和衣壳组装的化合物被发现有抗HBV的治疗潜能。由于HBV衣壳蛋白也可进入受感染细胞的核内，这些化合物可能通过靶向HBcAg核功能和(或)调整cccDNA转录活性等方面显著提高抗病毒活性。
在不同的HBV模型中，开展了大量关于BAY 41-4109的研究。BAY 41-4109的主要作用机制可能为抑制壳体化过程以及降低核心蛋白的半衰期。
该化合物可以与核心蛋白相连接，导致病毒衣壳形成异常。近期的研究表明，在HepG2.2.15细胞系及uPA-SCID人源化小鼠模型中，该化合物可以抑制HBV的复制。I a期临床研究已经证实每日单次给药在人体中的安全性。
该化合物是近期被发现可以与核心蛋白连接的高分辨晶体结构，为HBV衣壳抑制剂。这项研究更好的揭示了HBV对此类化合物存在潜在的天然抗病毒突变体的原因以及为未来设计更多以结构为导向的抗病毒衣壳化合物提供了基本信息。
为了减少亚病毒颗粒的过度产生以及缓解HBsAg介导的免疫抑制，恢复抗病毒免疫，有两种主要的方法可以在转录后水平抑制HBV基因表达。
α-葡糖苷酶抑制剂与三唑并嘧啶衍生物均可抑制HBV分泌。近期研究发现苯并咪唑类化合物BM601可以选择性抑制包膜蛋白至高尔基体的细胞内重新定位，在未影响细胞蛋白及HBeAg分泌的情况下，减少了HBsAg和HBV的释放。核酸聚合物(nucleic acid polymer, NAP) 靶向包括HBV在内的几种带包膜的病毒，具有广谱抗病毒活性。
PER 9AC（REP 2055）是40-核苷酸多聚胞嘧啶两性分子的DNA聚合物，短期内即可清除病毒，堪称乙型肝炎治疗的新希望。REP 9AC为双链DNA结构，可作用于病毒双链螺旋结构，阻止病毒和细胞膜融合蛋白结合，从而阻断病毒与细胞膜相互融合的过程，防止病毒侵入细胞。动物实验表明，REP 9AC可以控制HBV的传播和治疗停止后作用的维持。 NAP REP 2055并不能诱导人类原代肝细胞表达TNF、IL-6、IL-10、IFN A4或B1基因, 进一步说明该化合物缺乏直接的免疫调节作用。对已经有HBV持续感染的鸭子给予NAP 2055，以进一步明确该化合物在体内是否对HBV入胞后有抑制活性。在所有给予REP 2055治疗的实验组鸭子中，治疗28 d后，鸭子体内的HBsAg和HBV DNA水平迅速下降，抗-HBs的水平增加。给药后，经过9~16周的观察，6/11的鸭子呈现持续性病毒学应答：血清中，HBsAg和HBV DNA不能测出，无HBsAg或HBcAg阳性的肝细胞，只有痕量的cccDNA在肝脏可以检测到。其余5/11 REP 2055治疗组的鸭子中，在治疗停止后，所有HBV感染的标志物迅速反弹，经过9~16周的观察，肝脏内HBsAg、HBcAg以及cccDNA出现反弹，其水平与给予盐水的对照组相当。上述结果提示，NAP REP 2055能够实现对鸭子体内HBV感染的持续控制，可能与该化合物能够阻断HBsAg从被HBV感染的肝细胞释放有关。用REP 9AC治疗8~16周可使大部分患者的HBsAg阴转。目前处于Ⅱ期临床试验阶段。
RNAi技术可以通过短链干扰性dsRNA(double-stranded RNA,dsRNA)与靶向mRNA互补，进而导致它们的降解。基于HBV基因组重叠的特征，单一siRNA就能够干扰到全部HBV mRNA，因此，HBV是基于RNAi技术治疗的理想靶点。有研究发现，在(CHB)患者中，过多的HBsAg可以诱导免疫耐受，利用RNAi技术阻断HBsAg的产生，可以促进免疫系统功能的恢复。
ARC-520是Arrowhead公司研发的一种合成的多重共轭抗HBV siRNA化合物，目前开展了Ⅱ期随机双盲安慰剂对照研究。这项研究的人群为接受恩替卡韦治疗的慢性HBeAg阴性患者。结果显示，该化合物可以大幅度降低CHB患者的HBsAg水平。需进一步临床观察以明确HBsAg水平的下降是否能在一定程度上重建抗病毒免疫应答，实现对病毒和cccDNA更好的控制。RNAi临床应用的另外一个主要问题是其在体内的效率以及如何特异性的进入到肝脏，以肝细胞为靶向的核内体释放系统以及胆固醇结合的siRNA等的研发，有望在一定程度上解决上述问题。ARC-521是第二代RNAi制剂，主要是沉默所有起源整合的HBV DNA和cccDNA的HBsAg。
ALN-HBV是第二个治疗HBV感染的siRNA设计构想，主要是利用脂质纳米颗粒将药物递送至肝脏，能够显著降低HBV DNA水平。目前正在进行Ⅰ期临床试验。
TKM-HBV是第三个基于RNAi技术设计的治疗性药物，也是利用脂质纳米颗粒来实现向肝脏的传送。该药物可同时靶向HBV基因组的3个位点。在HBV人源化小鼠中，TKM-HBV可使HBsAg、HBeAg、HBV DNA 和cccDNA水平下降。该药的Ⅰ期临床试验已于2015年启动。
亲环素蛋白是存在于胞浆中的蛋白质，涉及包括HCV和HIV在内的多种病毒的生命周期。阿拉泊韦是亲环素A的抑制剂，目前已被开发用于HCV治疗。近期的临床前数据［35］显示该药也可抑制HBV DNA复制以及HBsAg的产生和释放。OCB-030是第二代的亲环素抑制剂［36］。临床前的资料显示，OCB-030具有双重抗HBV活性，即可直接抑制HBV复制，还可通过IFN调节因子进行免疫调节。
在过去的10年间，HBV感染的免疫学发病机制不断被揭示，促进了新治疗策略的发展。
TLR在识别外来病原体（包括细菌和病毒）方面发挥重要作用，是天然免疫应答的一部分。在HBV的发病机制中，TLR的表达及信号转导也牵涉其中。TLR7激动剂是正在研发中的抗HBV新制剂。
GS-9620是一种强效的TLR7激动剂，通过核因子-κB与Akt 通路激活树突状细胞继而产生大量细胞因子抑制HBV感染。2013年，动物研究发现GS-9620在黑猩猩上能产生长时间抑制HBV的作用。2015年，在土拨鼠模型上，证实短时间内限定性使用GS-9620可以产生抗病毒反应。目前正处于治疗CHB的Ⅱ期临床试验用以测定抑制成人HBV感染的有效性。
RG-7795是第二个TLR7配体，最早用于抗HCV的药物研发，目前正在被考虑用于HBV的治疗。
RIG-Ⅰ样RNA解旋酶是第二类天然免疫识别受体。RNA解旋酶识别胞浆内的双链RNA。RIG-I近来被认为具有双重抗HBV效应，既可介导Ⅲ型IFN应答，又可通过与HBV多聚酶的作用抑制病毒复制。
SB-9200 是口服的二核苷酸前体药物，活化的SB9000同分异构体产物连接RIG-I和NOD2，激发IFN应答。在临床前动物模型中具有抗HCV和HBV的活性。Ⅰ期临床试验多个提升剂量的研究已在HCV感染者中完成，结果显示，该药的血药峰浓度与每日HCV RNA最大抑制程度之间存在显著相关性。在HBV感染人群中的临床试验计划已于2016年启动。
慢性HBV感染伴有HBV特异性CD8+T淋巴细胞耗竭，主要表现为高水平的抑制性分子的表达，包括程序性细胞死亡蛋白（PD)1、细胞毒性T淋巴细胞抗原4、淋巴细胞活化基因3、T淋巴细胞膜3以及CD244。上述这些分子被称为“检查点”。检查点抑制剂在实验模型中通过促进再生，细胞毒以及细胞因子的产生显示出对病毒特异性 CD8+T淋巴细胞的挽救作用。
Nivolumab（BMS-936558）与 pembrolizumab（MK-3475）均为抗PD-1的单克隆抗体，在肿瘤治疗中，已经进入Ⅲ期临床试验。Nivolumab治疗乙型肝炎相关性进展性肝细胞癌的Ⅰ期临床试验已经开展。
动物实验表明PD-1/PDL-1Z阻断剂可显著提高HBV转基因小鼠体内HBV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的活性，提高脾脏淋巴细胞分泌IFNλ水平，能降低脾脏CD8+T淋巴细胞表面PD-1分子的表达，增强免疫应答水平。临床研究表明PD-1主要表达于活化的淋巴细胞和单核细胞，尤其是体内活化的T淋巴细胞表面，负性调节其活化，增殖和细胞因子的产生。抗PD-1治疗CHB的Ⅰ期试验尚未开始，但可能已在酝酿中。
cIAP被认为可以在HBV感染期间弱化TNF信号通路，限制被感染肝细胞的死亡，促进病毒感染的慢性化。利用cIAP1/cIAP2 缺陷小鼠模型，与野生型小鼠比较，HBV感染可以得到有效的控制。
Birinapant主要可以拮抗cIAP，使TNF依赖的以及CD4+T淋巴细胞依赖的信号路径活化，从而清除HBcAg阳性的肝细胞，迅速降低血清HBV DNA及HBsAg水平。拮抗cIAP可以促进HBV感染的清除，该药治疗HBV的 Ⅰ 期临床试验已于2015年启动。
治疗性疫苗治疗慢性HBV感染的研究工作已被广泛开展，通常是使用多种抗原或DNA片段作为靶分子。国内研究的乙型肝炎治疗性疫苗主要包括蛋白类疫苗、DNA疫苗、树突状细胞疫苗及新型佐剂疫苗等。多种动物实验证明疫苗可诱导机体产生特异性免疫反应。重组HBsAg疫苗通常为预防性疫苗。在慢性HBV感染者中，重组HBsAg疫苗可以成为促进抗病毒免疫的手段。由于高病毒载量将会导致免疫功能缺陷，因此，在给予治疗性疫苗之前，预先给予NAs以降低病毒载量是较为可行的策略。一旦病毒载量下降，病毒颗粒的抗原递呈作用会引起激烈的T淋巴细胞应答，从而打破免疫耐受。理论上虽如此，但一项临床随机对照研究显示，基于HBsAg疫苗联合NAs的治疗方案与NAs单独治疗相比较，并未显示出明显的优势。
GS-4774是一个来源于酵母重组热灭活的疫苗。一项随机、开放标签、剂量升级的研究显示，该疫苗具有良好的安全性和免疫原性。然而，近期开展的一项多中心研究显示，在已经使用NAs抑制HBV的CHB患者中，进一步联合使用GS-4774并未有利于HBsAg水平的下降或消失。
DNA疫苗也是重建抗病毒免疫应答的方法之一，其主要作用机制在于促进CD8和CD4 T淋巴细胞应答以及抗体的产生。近期一项前瞻性Ⅰ/Ⅱ期临床试验在已经服用NAs平均3年，HBV DNA不可测出至少1年的CHB患者中开展。结果显示，给予5次以HBsAg为基础设计的DNA疫苗，未能阻止因停用NAs所导致的HBV再激活，也未能重建抗HBV免疫应答。
总而言之，尽管治疗性疫苗在体外和动物模型体内显示出巨大的成功，但临床试验的结果不够理想，有待做更深入的研究。
随着抗HCV新药不断问世，使得医患双方都对抗HBV新药研发及进入临床充满了更多的期待，期望CHB的治疗能有实质性的推进。本文从病毒与肝细胞作用的相关环节及宿主免疫应答两个大层面对抗HBV药物的研发现状进行了简要总结。可以说，尽管很多研发中的新药在体外实验中都展现出较大的治疗潜能，但进入临床试验阶段，所需面临的问题接踵而来，在真正走向临床之前，有更多的困难需要克服。
目前，慢性HBV感染治疗目标主要是追求功能性治愈或HBsAg消失伴或不伴抗-HBs的产生。由于细胞内cccDNA的存在以及HBV DNA与宿主基因组的整合，达到前述治疗目标，就需要多方面的共同努力，推进抗HBV新药的研发并最终进入临床。正如本文总结的现有新药研究，尽管无法预测这些药物最终的结局，但有些问题值得进一步思索，如同时靶向cccDNA和宿主免疫重建能否与HBV治愈走得更近；新药物是否能证明其安全性优于目前的NAs；HBsAg定量以及HBsAg消失是否能担当起功能性及根除性治愈的最佳标志物；针对大量涌现的新药物的研发，亟待开发新型的、特异性的生物标志物来更好的评价新药疗效；关注联合治疗策略临床试验数据等。期待通过多方面的联合努力，能够有真正有效安全的抗HBV新药进入临床，开启慢性HBV感染治疗的新篇章。
高沿航， 刘培焱， 高普均. 慢性乙型肝炎抗病毒治疗新药研发进展［J］. 临床肝胆病杂志, 2016, 32(11): 2043-2049.
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