席鹏著
序
热。
五月的北京很热，但光学超分辨显微更热。
这个月，Springer这一赫赫有名的科学期刊与图书出版社，隆重推出了新的开放式期刊Optical Nanoscopy，总编正是Stefan W Hell教授，一位成功发明了多种光学超分辨方法的该领域奠基人。
时间倒推回2009年一月，Nature Methods评选“年度方法”(Method of the Year 2008)，将这一殊荣赐给了荧光超分辨显微技术。半年之后，Nature Photonics已经又按捺不住，为超分辨显微再次出了新的专辑。
Nature Publishing Group如此频繁地出新专辑，不敢说是绝后，但肯定是空前。
本文其实缘起于作者的一次演讲，由于听众来自不同学科，从本科生到教授博导，而且笔者的演讲是中午最后一个，所以不得不准备的浅显一些、娱乐一些。结果反倒有些意外，听众反馈真正地理解了这一领域的基本原理，并对她产生了浓厚的兴趣。所以笔者决定花一些时间来做科普，力求有更多人在理解的基础上，能够站在巨人肩膀上更进一步。
第一章： 山穷水尽疑无路
生物学家喜欢光学显微，几乎是一见钟情的事情。除了光学显微，还有哪种方法能够让人一眼就看清楚活细胞、活组织的内部结构呢？所以无怪乎光学显微的两个发明人胡克（列文-虎克和罗伯特-胡克），都是首当其冲地展示了光学显微在生物学上的应用。
显微的发展离不开光学，光学的发展需要三大件：理论、材料、工程。这三大件，居然在20世纪初的德国小镇耶拿(Jena)相聚了。那里有光学泰斗阿贝(Ernst Karl Abbe)、光学玻璃大家Otto Schott，和光学工程大师Carl Zeiss。后两人都同时进入商界，并以他们的家族名称作为公司的名称，至今仍是世界上数一数二的巨头。
图 SEQ 图 \* ARABIC 1 德国耶拿大学纪念Ernst Abbe的雕塑近照。
阿贝则深入研究了在传统光学中，如何能够提高分辨率，以及是否能够无限提高分辨率的问题。答案多少有点令人沮丧：光学显微由于光束直径有限，透镜大小有限，会产生衍射，从而具有一个所谓的衍射极限：
这个式子也是一个点扩展函数(PSF)的半高全宽的描述。它说明：如果一次把处于这个半径里面的粒子亮起来，那用光学显微是无法分辨它们的。所以，这个公式也就是光学显微分辨率的描述。
当大部分人都绝望而沉默的时候，有一个人突然灵光一闪：既然一次都亮起来不行，那我把其中一些弄灭可不可以？
爱因斯坦说：一个好问题，比一个好的解决方案都重要。他又对了。这一次，提问的人是Stefan Hell，那年，他29岁。
第二章： STED--You jump, I jump
在上一章，我们讲到一次不能分辨。Stefan Hell就在想，那么，是不是可以通过两步的方法来实现分辨？
这个问题如果用通俗的语言描述，就是，如果你有一根粗笔，怎么能够用它画细线？
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你可能会想到，买块橡皮。先画个粗的，再擦去两边的多余部分，自然就是细线了。没错，STED用的就是这个原理。
STED，全名是Stimulated Emission Depletion，受激辐射光淬灭。请看下图：
这幅图是一幅典型的STED系统结构示意图。在右上角，有一副能级图。其中，你看到红色的箭头和黄色的箭头了吗？
如果看到了，说明这两个箭头是很好"分辨"的，对不对？
好，接下来稍加科普一下这个图的意义：绿箭头代表粒子被激发从低能级S0到高能级S1，然后粒子会弛豫到亚稳态---高能级的最低点。接下来粒子会在这抽根烟，休息一下。好吧，现在已经禁烟了，所以他没抽烟，只是喝了个下午茶。这个时间短到几个纳秒。这个短暂的快乐时光被叫做粒子的寿命（lifetime）。然后粒子选择不再高帅富S1，回到屌丝阶层S0。（苏轼曰：吾欲乘风归去，又恐琼楼玉宇，高处不胜寒。。。）
这大概是绝大多数电子的选择。跳下来的时候它们会降落在S0能级的不同高处，并形成一定的分布。这个分布我们可以用发射光谱来描述其统计特性。
上图是一幅某染料ATTO647N的激发光谱（蓝色曲线）与发射光谱（红色曲线）。可见，粒子辐射跃迁从620nm-850nm均有可能，在670nm处几率最大。
这就是现实。
"这样不好，"有一个同学突然站起来说，"看着不整齐"。他，就是爱因斯坦。
爱因斯坦补充说："大家都看过《泰坦尼克号》这部电影了吗？最感人的，不就是You jump, I jump吗？"
"如果Rose遇到了Jack，那么他俩会一起跳，不分你我。"这句话，让Titanic的导演詹姆斯·卡梅隆得了奥斯卡小金人，也让相信小爱同学预言的Chaels Townes, A. Prokhorov 及N. Basov得了诺贝尔奖。后来发明的激光Laser,其中的SE就是受激辐射。正因为这整齐划一的一跃，使得激光成为功率最强的光。
[注：诺贝尔奖委员会有时候是十分无厘头的，比如爱因斯坦竟未因他的广义狭义相对论、受激辐射等获得诺贝尔奖。反倒是一个光电效应获奖了。惊人相似的不公正待遇还有激光的发明人Theodore Maiman，教科书里第一人，一直未得诺奖。]
回到超分辨的问题，当年还是个博士后的Stefan Hell躺在宿舍里，突然灵光一闪："X，我可以把受激辐射和自发辐射分开！"
当然，笔者无从考证Stefan当年是否用了国骂，但是此时此刻的激动心情，可能只有这样方能表达。
咱们再回到刚才那个黄箭头和红箭头。如果绿色箭头引发的荧光现象的最小PSF是绿色的圆圈半径，这时候如果给它套上一个红色橡皮擦（粒子做受激辐射波长相同），不久剩下为数不多、居于中间的荧光了吗？缩小点扩展函数，这不就是超分辨吗？
接下来的实验就非常简单了：选一种合适的荧光物质，按顺序先给激发脉冲(2ps左右)，等它跃迁上去了马上给一个受激辐射波长的脉冲（250ps左右），然后用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测过来的自发辐射信号。受激辐射越大（橡皮擦得干净），剩下的PSF越小，也就是分辨率越高。这个就是Pulsed STED.当然，如果你觉得时间控制太麻烦，其实可以都给连续信号，因为反正二向色镜能区分，只不过擦得没那么干净罢了。这个就是CW STED。
对仪器方面的补充说明：要想STED，先做Confocal。顺着635nm，DC1将激发光通过物镜照到样品上；从样品回来的荧光信号透过DC1,到达APD被探测。移动物体，实现三维共聚焦成像。 接下来STED。利用一个位相片实现光位相调制，最终在焦点处形成环形光分布。放上样品，成像，STED实现。
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