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Gambaro, G., Soldati, L., Vezzoli, G. (2010). Genetics and Molecular Biology of Renal Stones. In: Rao, N., Preminger, G., Kavanagh, J. (eds) Urinary Tract Stone Disease. Springer, London. https://doi.org/10.1007/978-1-84800-362-0_2

肾结石的遗传学和分子生物学

迄今为止，钙肾结石的遗传学研究通过检测连锁不平衡或位点与结石病之间的关联来评估单个候选基因。他们已经确定了钙敏感受体 (CaSR)、维生素 D 受体 (VDR) 和碳酸氢盐敏感腺苷酸环化酶基因的潜在参与。除了对人类的研究外，对不同基因敲除小鼠的研究使我们能够包括磷酸盐重吸收载体 NPT2 基因、caveolin-1 基因、调节钙和尿酸盐重吸收的蛋白质 NHERF-1 基因、骨桥蛋白和 Tamm -Horsfall 蛋白是可能的决定因素之一。然而，基因之间以及环境因素和基因之间的相互作用通常被认为是钙结石形成的基础。因此，迄今为止，基因研究未能显着促进我们对钙质肾结石原因的理解，尽管它们使我们能够评估问题的规模并建立面对它的标准。使用现代生物技术和生物信息学为研究人员提供的工具，我们对导致钙结石的原因的进一步了解可能会产生。

对患者的代谢研究已经确定，钙质肾结石可能与单价和二价电解质排泄的各种缺陷有关。这些疾病中最广为人知的是原发性高钙尿症，50% 的结石患者可检测到。1其他，如低柠檬酸尿、肾性低磷血症、高尿尿以及钠和氯化物排泄升高伴随结石形成疾病的频率较低。因此，仅凭这些条件的强度就不可能预测钙结石的发作，这导致我们假设许多因素相互作用和/或结合在一起使个体易患钙质肾结石。

在过去的十年中，肾脏病学研究的重点是确定钙性肾结石的遗传原因。然而，我们对该主题的理解并没有显着提高，因此无法制定有效的预防和治疗标准。在诱发因素中，我们倾向于考虑遗传和环境起源的因素，尽管两者之间的区别是模糊的，因为肾结石可能是基因与环境相互作用的结果。1 - 4因此，肾结石是具有多因素发病机制的复杂疾病之一，如高血压、糖尿病、缺血性心脏病和骨质疏松症。尽管我们的生物/分子知识和新的生物技术的进步为我们提供了强大的分析工具，但研究其原因必然是困难的。这些方法无疑使基因研究取得了进展，但我们对致病图谱的复杂性以及充分理解它所需的承诺的认识同样有所提高。

2遗传连锁研究

钙质肾结石的基因研究始于 1990 年代后半期。早期研究是使用连锁方法进行的，该方法评估肾结石与结石形成家族成员的染色体基因座的共分离。这些方法在指向特定疾病，特别是单基因疾病中涉及的基因方面强大而准确，这就是它们被应用于肾结石的原因。5一些研究还评估了与该疾病有关的表型，例如高钙尿症。

根据流行的病理生理学假设，一些连锁研究认为候选基因的位点被认为具有致病作用。该策略应用于 300 多对患有肾结石的法裔加拿大兄弟的样本，其染色体基因座编码肾 1α (α)-羟化酶 25(OH) 维生素 D，即维生素 D 受体 (VDR)，或钙敏感受体（CaSR）进行了测试。使用特定的多态性标记对每个区域进行分析。25-二羟基维生素D的1α(α)-羟化酶基因座（染色体基因座12q13.1-q13.3）是该样本中第一个被研究的，但结果可以证实它没有作用。6使用六种不同的标记分析了染色体 12q12-14 上 VDR 的基因座，其中四种与肾结石出现连锁不平衡，只有一种与高钙尿症有关，但意义不大。7最后，在法国-加拿大兄弟系列中，CaSR (3q13.3-21) 的基因座与肾结石的发病之间没有发现任何联系。8

当逐代研究结石形成者的家庭成员时，关联研究产生了更重要的结果。一项研究重新考虑了印度家庭中 VDR 的基因座，并基本证实了在法裔加拿大兄弟中获得的结果。9另一个证实在七个欧洲家庭中没有 CaSR 基因突变。10只有一项基于家族的研究使用了覆盖整个基因组的染色体标记（全基因组扫描）：这种方法使他们能够在没有任何初步致病假设或候选基因定义的情况下进行。在用多态性标记探索全基因组后，研究结果表明可以找到与肾结石有关的基因的位点。换句话说，全基因组扫描能够根据所获得结果的强度发展致病假设。采用这种方法，在三个患有吸收性高钙尿症和肾结石的家庭中，确定了染色体 1q23.3-q24 与高钙尿症之间的联系。11这一发现的解释委托给随后的病例对照研究，该研究发现高钙尿症与可溶性（碳酸氢盐敏感）腺苷酸环化酶（sAC）基因的六种多态性之间存在关联。相同的多态性也与低骨矿物质量有关。12 sAC 基因的功能作用尚未阐明，尽管我们知道它在肾、肠和骨细胞中表达，并且其功能由碳酸氢盐激活并由二价阳离子调节。13然而，在一项针对 9 个家族的欧洲研究中，并未证实 sAC 基因与高钙尿症之间的联系。14

尽管连锁研究的可靠性更高，但使用其他策略进行的研究，例如分析基因型与钙性肾结石之间的关联，数量要多得多。这种趋势的原因在于所涉及的许多实践和理论问题。首先，很难找到至少涵盖三代人且数量大到足以进行连锁研究的家庭群体。另一个问题在于连锁研究无法识别具有稀缺表型效应的基因。3 , 5这个问题特别适用于肾结石，因为结石可能不是由一个或几个具有强烈优势的基因突变引起的，而是由许多基因诱导的复合变化引起的，每个基因都不能单独引起这种疾病。15在这种情况下，因果底物可能如此多变和异质，以至于很难进行遗传研究和识别单个基因。

除了这些具体问题之外，将个体归类为结石形成者还有更普遍的困难。事实上，肾结石可以在任何年龄发展，甚至可能无法识别。也可能是具有易感遗传遗传的个体不会形成结石，因为具有抗成石作用的其他基因或营养物质胜过成石因素。16肾结石中这种现象的一个明显例子是为高钙尿症患者开出的低钠饮食。这些人的结石风险因较高的钙排泄水平而增加，但限制他们饮食中钠和氯化物的摄入会降低他们与高钙尿症相关的结石形成潜力，已知高钙尿症具有遗传成分。17也可能是一些遗传原因在肾结石复发患者中起作用，但在那些一生中只产生一颗结石的患者中则不然。18

3遗传关联研究

将基因型与钙肾结石相关联的研究是遗传连锁研究的最常见替代方法。他们评估等位基因或基因型在肾结石患者中是否比没有肾结石的患者更常见。寻找这种关联可能涉及分析整个基因组或仅分析候选基因。在肾结石设置中，迄今为止仅测试了候选基因，2但使用全基因组标记进行的分析代表了前进的方向。19在关联研究中，针对沿候选基因序列排列的单碱基多态性对患者和对照进行基因分型。这些多态性的平均频率为每 1,200 个碱基一个，并有助于表型的变异性。它们可以放置在编码区并引起氨基酸变化，或放置在非转录区并保持蛋白质中的氨基酸序列不变。它们对表型的潜在影响通常仍然未知，这是此类分析的一个关键缺点。20

考虑到未转录的 3' 区域或转录起始密码子的多态性，使用该方法分析的第一个基因是 VDR 基因。在各种研究中，这些多态性与钙肾结石有关，一些人还观察到携带 3' 末端区域多态性等位基因变异的患者在生命早期患上了结石，并且具有更具侵袭性的疾病形式和较低的尿柠檬酸盐排泄水平. 21 – 23虽然有些作品没有证实这些关联，但24总体而言，获得的结果给人的印象是 VDR 基因多态性可以在钙性肾结石的发病中发挥作用。所鉴定的 VDR 基因多态性是否对疾病有重要的功能影响，或者这种关联是否仅仅是由于它们与其他功能相关的多态性的共分离（即它们处于连锁不平衡状态），还有待观察。它们与肾结石的功能联系通常通过 VDR-维生素 D 复合物激活肠道钙吸收这一事实来证明（图2.1）。然而，VDR-维生素 D 复合物似乎也能够减少尿中柠檬酸盐的排泄。事实上，它可以通过刺激近端小管细胞腔膜上的柠檬酸重吸收载体来抑制磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的表达，从而限制其肾脏排泄。25

通过分析 CaSR 基因，研究其外显子 7（3'-末端）的多态性以及第一个内含子和启动子附近未转录的 5' 区域的多态性，获得了特定的结果。外显子 7 的 Arg990Gly 多态性与患有和不患有肾结石的患者的高钙尿症有关。用 CaSR 基因转染的 HEK293 胚胎肾细胞的体外结果表明，Arg990Gly 多态性可以引起 CaSR 基因的功能增益。26 , 27携带等位基因变异的原发性和继发性甲状旁腺功能亢进症患者的 PTH 平均循环水平低于精氨酸等位基因携带者，这一事实证实了这一假设。28因此，密码子 990 处的甘氨酸等位基因在抑制亨勒袢升支较厚的细胞中钙重吸收方面的效果较差，从而使携带者倾向于更高的钙排泄水平（图2.2 ）。）。这就提出了一个问题，为什么这些人也没有像 CaSR 基因激活突变的携带者那样低钙血症：也许 Arg990Gly 多态性对甲状旁腺和肾细胞使用的信号系统有不同的影响，因此它可以抑制肾小管钙重吸收和甲状旁腺细胞中 PTH 的产生程度不同。这种多态性在钙尿症中的重要性也已在原发性甲状旁腺功能亢进症患者中得到证实，因为携带 990Gly 等位基因变异的患者尿钙排泄水平更高，并且更频繁地形成结石。28

位于第一个内含子或未转录的 5' 区域的 CaSR 基因启动子区域的多态性最近与意大利人群中的肾结石有关。29它们不需要氨基酸变化，并且考虑到基因启动子的接近性，它们可能通过改变基因的转录和肾乳头小管细胞中 CaSR 的表达而生效。由于肾乳头中的钙浓度很高，CaSR 的不同细胞表达可能对钙盐的沉淀和草酸盐结石的形成至关重要。30

编码骨桥蛋白、尿激酶、白细胞介素受体 1、肠道瞬时受体电位阳离子通道 (TRPV6)、E-钙粘蛋白和表皮生长因子的基因的多态性也与肾结石有关。14 , 31 – 36这些基因在肾结石中的病理生理作用仍不清楚，也没有工作证实初步结果。另一方面，已经获得了基因TRPV6的功能结果，该基因编码在肠粘膜中表达的钙通道，据此激活突变将通过增加肠钙吸收与肾结石32相关（图2.2）。

关联研究当然比关联分析更容易执行，但它们并非没有问题。前面提到的将个人归类为受影响的困难也适用于这种情况；由于遗传底物或环境因素的差异可能导致无法识别的分层，从而使不同人群不适合进行比较，因此它们在不同人群中的结果可重复性较差。37这也适用于相反的意义；也就是说，由于不知情的有利分层，为假阳性结果创造了条件。尽管如此，这些研究也可以揭示对表型影响有限的基因，高钙尿症和 CaSR 基因 Arg990Gly 多态性之间的关系可能就是这种情况。发现等位基因变异 990Gly 与高钙尿症相关，并解释了一项研究人群中 4% 的钙尿症表型变异性24；反之亦然，CaSR 基因的位点与法国 - 加拿大兄弟对中的高钙尿症或肾结石无关。8 Arg990Gly 多态性对钙尿变异性的这种稀少影响可能是连锁研究的负面结果的原因。

迄今为止进行的关联和连锁研究选择了提前研究的基因和多态性。虽然基因的选择通常基于病理生理学知识，但多态性的选择很少受功能知识的指导。20由于引入了全基因组扫描方法，现在可以避免这一重要弱点，现在可以以仍然可观但可持续的成本进行，但这需要能够测试和处理大量样本和数量的技术和生物信息学软件产品数据的。最后，无论采用何种研究策略，遗传发现都必须通过细胞和动物模型的功能研究来证实。这些潜在的发展和前面提到的经验导致近年来对关联研究的重新考虑。

4遗传病动物模型

基因敲除小鼠是经过基因编程不表达给定基因的动物。敲除菌株表型中肾结石的发展表明沉默的基因在预防肾结石的发生方面很重要。已知五种基因敲除小鼠会产生肾结石。没有slc26a13基因的小鼠缺乏在肠腔中分泌草酸盐的载体。结果，这些动物在有机体中积累草酸盐，其肾脏排泄增加，导致尿液沉淀和结石形成。38 小窝-1敲除小鼠不能在肾细胞中产生caveol；也就是说，质膜内陷，对细胞功能很重要的蛋白质（例如钙泵、CaSR 和 VDR）聚集在这里。这些小鼠无法从肾小管腔吸收钙，因此变得高钙尿，在肾小管中形成磷酸钙沉积物。39第三个基因敲除小鼠品系缺乏调节钠、钙和尿酸重吸收的蛋白质 Na ⁺ /H ^{+交换调节因子 (NHERF-1)。}随着乳头状钙沉积物的形成，钙和尿酸盐的排泄增加。40在双敲除小鼠品系中，对于骨桥蛋白和 Tamm-Horsfall 蛋白，39% 的动物存在乳头状间质沉积物，这可能是因为它们的尿液不能抑制钙盐沉淀。这两种蛋白质似乎具有协同抗结石作用，因为仅敲除其中一种或另一种会导致仅 10-15% 的动物出现乳头状沉积。41

最后，肾钠/磷酸盐协同转运蛋白 (NPTa) 基因敲除小鼠是一个有趣的模型，其表型特征是继发于肾磷酸盐丢失、高肾维生素 D 合成、高钙尿症和肾结石形成的低磷血症。42这张图片与常染色体显性遗传性低磷性佝偻病伴高钙尿症 (HHRH) 患者的情况相似。因此，NPT2a基因敲除小鼠被认为是HHRH患者肾功能损害的模型。然而，在 HHRH 患者中未发现NPT2a基因突变，而在近端磷酸盐 NPT2c 携带者中已发现突变。43这意味着人和小鼠近端磷酸盐重吸收的组织不同：而前者可能使用 NPT2c 作为近端小管细胞磷酸盐重吸收的主要载体（图2.3)，后者使用 NPT2a。这两种载体在功能上有所不同，因为 NPT2a 维持三种钠离子和一种磷酸盐的电生协同转运，而 NPT2c 产生重新吸收两种钠离子和一种磷酸盐的电中性协同转运。NPT2a 或 NPT2c 缺乏似乎对骨骼的影响不同，因为小鼠的表型不包括在人类中观察到的佝偻病。可能是这两种磷酸盐载体在骨细胞中的表达不同：特别是，NPT2a 出现在破骨细胞中，而 NPT2a 敲除小鼠的破骨细胞似乎更少、活性更低。44

使用前面提到的动物品系获得的经验表明，基因敲除小鼠是有用信息的来源，并且相对容易获得。它们可能为新的研究假设铺平道路，但它们并不代表研究的基石，因为无论如何将研究结果从老鼠身上转移到人类身上都需要了解正在研究的蛋白质在人类生理学中所起的作用。骨桥蛋白和 Tamm-Horsfall 蛋白以其在人类中的抗结石活性而闻名，而 slc26a13 草酸盐载体和 NHERF-1 的作用尚未确定。对 NPT2 的研究表明，将小鼠获得的数据传输给人类并不总是可能的。

5未来的研究领域

从前面的考虑不难看出，肾结石所涉及的基因以及疾病是如何传播的还有待解释。在选择候选基因进行研究时，研究人员将重点放在与钙代谢相关的基因上，其中VDR、CaSR和sAC基因似乎有助于钙结石的形成，但其贡献程度尚不清楚。这些基因可能与原发性高钙尿症和骨质疏松症的发病有关，因此这些疾病与肾结石的关联强调了高钙尿症作为致病因素的重要性，并解释了结石形成者中骨质疏松症的高频率，而与钙尿水平无关。尽管如此，除了钙代谢外，肾电解质代谢的其他方面仍有待探索，这很可能在结石形成背后的发病机制中也很重要。一个例子来自表明 sAC 基因潜在的结石形成作用的研究。因此，人们对全基因组扫描充满兴趣。特别是因为它们将给我们提供机会来制定新的假设和研究观点，以克服我们当前理解的限制。

总的来说，这里列出的研究考虑了单个基因，而不同基因之间以及基因与环境之间的相互作用通常被认为是肾结石发展的基础。结石形成基因可以或多或少复杂的方式与环境相互作用，从而产生多种形式的相互作用。在目前的研究状态下，最有趣的相互作用是表观遗传类型，其中环境影响可以稳定的方式改变表型，可以传递给后代，而不会改变基因型。45他们通过各种机制修改基因表达来做到这一点。在人类中，最常见的是基因启动子区域的甲基化，这可能意味着在高甲基化或低甲基化的情况下基因转录分别受到抑制或重排。46在胎儿和围产期，不同的环境条件被认为能够产生表观遗传变化，从而影响新生儿对慢性疾病的易感性。由于表观遗传分析，基因与环境之间相互作用的研究注定会在肾结石环境中逐步扩大，但此类研究尚未在流行病学水平或动物模型中进行。

6结论

总之，我们可以说，对肾结石进行了 10 年的基因研究，并不能显着提高我们对导致钙质肾结石的原因的理解。但是，对于所有致力于这一困难、阴险研究领域的人来说，这个结论是不公平的，而且无论如何，对于所有复杂的疾病，更普遍地说，也是如此。事实上，直到不久前可用的基因调查工具对单基因孟德尔传播疾病产生了令人兴奋的结果，但对更复杂的疾病却产生了令人失望的结果。近年来，新的人类基因组扫描方法、更便宜的高通量基因调查工具以及能够管理从大量人口样本中收集的数据体（就数量而言）的生物信息学软件都已面世，然而。迄今为止进行的研究只是初步调查，尽管存在局限性，但它们可用于为未来的研究工作奠定基础。获得的结果主要与肾结石中钙代谢的变化有关，但他们也制定了标准并测试了问题的维度。鉴于这些研究，现代生物技术和生物信息学工具，只要得到充分利用，应该能够帮助我们进一步了解钙质肾结石背后的遗传原因。然而，在这项工作中，重要的是要承认一个基本步骤涉及样本收集，以使其在表型上尽可能同质。为了使用我们的现代工具获得显着效果，

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