尿结石成分分析是研究结石的主要手段之一。它可为深入探讨尿石成因提供依据,同时对尿结石的临床治疗也有重要指导意义。分析尿结石成分的方法很多,如化学分析法、扫描电子显微镜(SEM) 法、偏光显微镜法、X线衍射(XRD) 法、红外光谱法、热重量分析法等。
近年来 , 红外光谱被越来越多地用于结石成分分析的研究。这在于红外光谱与其它方法相比较具有操作简便、测谱速度快、样品使用少、能同时进行定量定性分析、测定结果准确可靠等优点。在结石成分中 , 每个化合物都有其特征的红外光谱。常见的尿石成分有草酸钙、磷酸钙、磷酸镁铵、尿酸及胱氨酸等 , 其中各种成分的功能都有其特征性振动 ( 包括伸长和弯曲 ), 因而都有其相应的红外吸收范围。
1．红外吸收光谱的原理
利用样品的红外吸收光谱图对物质进行定性、定量分析以及测定分子结构的方法 , 称为红外吸收光谱法 (infrared absorptionspectroscopy) 或红外分光光度法 (infraredspectrophotometry), 简称红外光谱法。
红外区可分成三个区域 , 即近红外区、中红外区和远红外区。近红外区波长为0.76~2.5μm主要用来研究O-H 、 N-H 、 C-H 键的倍频吸收以及组合频的吸收 ; 远红外区波长为50~5000μm为分子的纯振动能级跃迁、晶体的晶格振动、金属有机化合物的金属有机键的振动、许多无机化合物的键振动等 ;波长为2.5~50μm中红外区最为有用, 该区的吸收主要是由分子振动的能级跃迁引起的 , 许多无机化合物的化学键振动的基频均出现在此区域 , 因此,分析结石成分时，选择4000~200cm-1 的红外光谱仪基本可以满足分析的需要。红外光谱的分析原理是以红外光照射一物质时,该物质的分子将吸收一部分光能,并将其变为振动能和转动能,其相应的光谱出现于中红外区(2~25μm)。不同物质转动能级的分子数不同,其吸收强度也不同,因而可通过测定红外光谱来反映其结构特征。当红外光通过样品池后 , 若样品分子由于振动和 ( 或 ) 转动产生能级跃迁所需的能量恰好与某一波长的红外光的能量相等 , 就会产生吸收 , 从而使透光率下降。由于不同物质及同种物质的不同结构发生能级跃迁所需的能量各不相同 , 从而会产生不同的吸收 , 若将透过的光用单色器进行色散 , 就可以得到一个带暗条的谱带。反应在红外光谱图上 , 就会产生一个个与特定波长相对应的的 " 波谷 ", 即红外光谱的吸收峰。每个不同类型的化学键有不同的振动频率,并且在两个不同的化合物中,即使相同类型的键,由于其化学环境并不相同,所以不同结构的分子,就会吸收不同的红外辐射能量而产生相应的红外吸收光谱。根据各种物质的红外特征吸收峰位置、数目、相对强度和形状(峰宽)等参数,就可推断试样物质中存在哪些基团,并确定其分子结构,这也是红外吸收光谱用于定性和结构分析的依据。测定红外光谱的设备是红外分光光度计 , 又称红外光谱仪。最常见的有光栅红外分光光度计和傅里叶红外分光光度计 (FTIR)。 FTIR具有分辨率高、波数精度高、扫描时间快、灵敏度高等优点 , 现其应用日益广泛 , 已逐渐取代光栅红外分光光度计。红外吸收光谱图多用 T-ν或 T- λ曲线表示 , 用纵坐标表示透光率 (T), 用横坐标表示波数 (ν) 或波长 ( λ ) 。
2．红外光谱法的特点
(1) 红外光谱是依据样品在红外光区吸收峰的特征来推测分子中官能团的存在与否及其邻近 , 进而确定化合物结构的。因此 , 红外光谱被认为是物质的" 指纹 " 。
(2) 红外光谱特征性高。红外光谱信息很多 , 可对不同结构的化合物给出特征性的图谱。
(3) 红外光谱不破坏样品 , 并且对任何状态的样品都适用 , 测定方便 , 制样简单。
(4) 分析时间短。一般红外光谱做一个样可在 10 分钟内完成。如果采用傅里叶变换红外分光光度计 , 在 1 秒内就可完成多次扫描。
(5) 所需样品用量少。红外光谱分析一次用量为 1~5mg, 有时甚至可以只用几十微克 , 且可以回收。
3．结石样品的制备和分析
结石的红外光谱分析是一个比较复杂的过程。要得到准确的测定结果，必须做到统筹安排。用红外光谱分析泌尿系结石的总体步骤如表 1所示。目前制作待测样品最合适的方法是 KBr压片法。先将 200~300mg 结石在玛瑙研钵内充分磨细 , 取过 200 目筛的粉末。由于研细的 KBr 极易吸潮 , 需在烘箱中于 110~150 ℃充分烘干 ( 约需 48 小时 ), 并置于含 P2O5或分子筛的干燥器内 , 室内相对湿度要低于50%。将 1~ 1.5mg 结石样品在玛瑙研钵中充分磨细 , 再加入 200mg 干燥的 KBr 粉末 , 使结石样品在 KBr 中分散浓度为 0.5%~10%, 继续研磨 30 秒即可装模压片。压片装置包括振动球膜、压模、油压机和真空泵。压模由模膛、柱塞、顶模、底模和底座组成。模膛和底座的材料是不锈钢的 , 而顶模、底模和柱塞则由钼钢或工具钢制成。压片时, 装好模膛、底模和底座 , 将磨好的粉末用不锈钢铲转移到底模面上并刮平 , 然后小心降下柱塞将样品粉末压平 , 并轻轻转动使粉末分布均匀 , 非常小心地慢慢拔出 ( 太快会使粉末抽出 ), 并将顶模轻轻放入 , 其上放上柱塞 , 即可放在油压机上压片。使用10t 的油压机即可。压片时，将压模连上真空泵抽空两分钟后，逐渐加压至 8000kg/cm2 左右 , 保持两分钟后除去真空泵 , 缓慢降压。取出压模 , 除去底座 , 颠倒压模 , 在柱塞外圈垫上支撑管 , 将片顶出 , 然后放于片夹上记录图谱。KBr 在潮湿空气下对压模有腐蚀性 , 因此，用完压模后，应将其放于干燥器内保存或用水洗净 , 使压模温度高于室温 10 ℃以上 , 使片不致在压制过程中受潮或发毛 , 压片时压力不要过大 , 以免将压模破坏。固体样品测试时要注意同质多晶形的影响 , 即有时会出现测得的图谱与对照的图谱不相符合。为排除此影响 , 可将样品和对照品同用一种溶剂溶解 , 在水浴上蒸干后 , 再压片测定。红外光谱法所用的 KBr 压片 , 在 4000~670cm-1 应有大体平坦的基线 ( 基线应 >75% 透光率 ), 除 3440 cm -1和 1630cm -1 的峰外 , 不应有大于基线 3% 透光率的峰。片子可以保留以备复验 , 但放置时间稍长 , 片的透明度即逐渐降低。
表1结石红外光谱分析的流程
步骤 | 具体内容 |
1. 结石概貌 | 发生部位 数目、大小、重量 颜色、外表、质地 |
2. 样本采集 | 结石直径 >3mm: 切割或锯开 , 必要时可从不同层面采样 , 将其研磨成粉状结石直径运 3mm: 在玛瑙研钵内将其全部磨碎 |
3. 样品数量 | 用普通压模工具 , 需 0.2~1.5mg( 压制成片直径为 13mm) 用微型压模工具 , 需 100ng~20μg ( 压制成片 , 直径为 0.5-2mm) |
4. 载体物质 | kBr, 光学上纯净 用普通压模工具 , 需 200-- 300mg用微型压模工具需 5--10mg |
5. 样品研磨 | 在玛瑙或不锈钢乳钵中将样品与载体物质混合后研磨 20~30s |
6. 压制 KBr 片 | 真空下制作 ( 排除空气和湿气 ); 在一特制工具中以 8000KPa/cm2 压制 KBr 片 , 约需 30s |
7. 制样总时 | 约 5min |
8. 记录光谱 | 4~8min |
9. 评估 | 与参照光谱对比 |
10. 有效工时 | 10~15min |
3．红外光谱的定性定量评估
泌尿系结石样品分析的主要目的是将其所含有的所有成分进行定性。只要具有参照光谱和光谱表一一即对吸收峰的位置、强度和数量进行比较所需的全部资料 , 就可得出阳性鉴定结果 , 因而对于纯净物质的鉴定来讲 , 并没有困难。如果某些独特的吸收峰不能通过与参照光谱进行对比而识别 , 或某些特定吸收峰的位置和形状与参照光谱相比发生改变 , 就说明泌尿系结石样品中还存在有其他一些物质。可将这一附加信息与其他参照光谱进行对比 , 亦可鉴定其究竟为哪些光谱所属。每种分析方法的质量如何 , 应通过其检测物质的相对含量来加以判断。红外分光光度计对于泌尿系结石内所含各种物质成分的分析范围很宽 , 从经验上讲 , 含量为10%的物质可被鉴定出来 , 而含量为 5% 的物质大多数亦可被鉴定。差比光谱学也有助于鉴定和识别出混合物中更低浓度的物质成分。此外 , 通过计算机，利用参照光束通过补偿方法可将已知物质大量地从光谱中去除 , 从而可增加未知物质的浓度。但这种方法在泌尿系结石分析中至今仍未使用。如经以上定性分析后 , 检测到两种或更多成分 , 则有必要进行定量评估。但因无助于进一步的诊断或治疗 , 故一般不必做更精确的定量分析。通常 , 在精确的定性评估后 , 将所含物质以 5%~10% 的梯度进行定量鉴定即可。根据文献记载 , 在各种结石中 , 约有 30 种不同的化合物。此外 , 用药后的药物成分或其代谢产物也可出现在结石中。常见结石有草酸钙结石、磷酸钙结石磷酸铵镁结石、尿酸结石及胱氨酸结石等。实际上 , 单一成分的 " 纯 " 结石是不存在的 , 所谓的 " 纯 " 结石是指某种成分的相对含量占 95%以上的结石 , 其实 , 多数结石为多种物质混合组成。
目前最简单最准确的定量评估方法即是与从混合物中所得的参照光谱进行对比。但这需要一定的经验，它要求在细节上密切观察相关红外光谱的任何微小的变化 , 例如 , 吸收峰延长 , 某些吸收峰 " 肩峰 " 形成 , 以及吸收峰群相对强度变化等。整个分析过程中最关键的步骤就是红外光谱的评估。当然 , 准确而快速地评估红外光谱需要一定的经验 , 因为在对混合物的分析中 , 即使光谱中极微小的改变也不能忽视。如联接数据信息库的在线终端辅助 , 评估则会更为容易。光谱库内存有关纯净物结石和混合物结石的红外光谱 , 若将样品光谱与其进行对比 , 即可准确评估出结石成分。
4．常见尿石的红外光谱分析
A 一水草酸钙
这种成分在上尿路结石中最为常见。在红外光谱图中 , 一水草酸钙的吸收峰位于 3480--3050,1620,1320,950,885,780,655cm-1 。 1620 和 1320 cm-1 处的吸收峰分别由于 C=O 和 0-O 各自振动所致。 3480--3050cm-1 处的宽吸 收峰为水分子振动 , 被分裂成 5 个单峰。
B 二水草酸钙
二水草酸钙多见于结石的表层部位。这种成分的红外光谱图与一水草酸钙相比 , 在 3460cm-1处虽亦有宽吸收峰 , 但无分裂现象 , 在 665cm-1 处无吸收峰
C 羟基磷灰石
这是仅次于一水草酸钙的比较常见的结石成分 , 往往与草酸钙共同存在于结 石核心 , 纯羟基磷灰石结石比较少见。羟基磷灰石的吸收峰不多 , 主要表 现在 1100--1000,605,560cm-1 处。
D 碳酸磷灰石
对尿路结石用化学定性分析法检出的所谓" 碳酸钙 ", 实际上几乎都是碳酸磷灰石 , 碳酸钙只是在非常罕见的情况下 ,才以矿物方解石的形式出现于尿路结石中。碳酸磷灰石的红外光谱吸收峰在 1630,1460,1415,1100--1000 和 870,605, 570,450 cm-1 处 ( 图4)
E 六水磷酸铵镁
这种成分在上尿路结石中比较少见 , 与尿路感染有关。红外光谱图在 3500--3000,1650,1440,1400,1100--1000,750,570 cm-1处有吸收峰 ( 图5) 。
F 尿酸
结石中的尿酸有无水尿酸和二水尿酸两种 , 但绝大多数是无水尿酸。在红外光谱图中 ,无水尿酸的吸收峰位于1650,1590,1400,1345,1300,1120,1025,900, 785,700,620,575cm-1处 ( 图6) 。
G 胱氨酸
胱氨酸结石的吸收峰主要位于 1600-1200,1125,1020,965,850,780,680,
610,530 cm-1( 图7), 其典型图像易于其他成分相鉴别。
联系客服
