前两期WB实验推文小赛介绍了WB实验的蛋白提取、蛋白定量和电泳，本期将主要介绍转膜。
转膜（又叫转印）是利用电场将电泳后凝胶中的蛋白质 、核酸等转移至膜上，形成印迹。
转膜方法
WB转膜方法主要分为半干转法、湿转法。
半干转法：转膜时间短，速度快，所需缓冲液更少，但是干燥条件下转膜容易失败；
湿转法：是比较常用的转膜方法，相较于半干转法，不会因为膜的干燥而失败，更稳定。
转印膜
转印是对Western Blot最终结果影响最大的一步，转膜的好坏直接决定了实验结果。
常用的转印膜主要有PVDF膜和NC膜（硝酸纤维素膜）。
挑选转印膜时需关注膜的种类、孔径、结合蛋白的能力等，这些都会影响后续显色检测。
实验材料准备
准备好转膜缓冲液、转印电泳仪（SVT-2）、转膜滤纸、转膜海绵和 PVDF 膜、容器、玻璃棒、试管、镊子、平皿等；
制作转膜“三明治”
在盛有转膜缓冲液的容器中操作，按‖正极（+，红色面）｜海绵｜滤纸｜膜｜胶｜滤纸｜海绵｜负极（-，黑色面）‖的顺序，在转印夹中依次放置好转印材料。按照红对红，黑对黑的方向，将转印夹放入转印芯（转印芯可同时放置两块转印夹）；
转膜
连接电泳电源，设置转印条件，开始转膜。转膜过程中，可将加满转膜缓冲液的转印槽置于冰浴中（可缓解实验过程中的发热现象）。
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转膜验证
为保证实验准确性及为排除抗体原因导致阴性结果，可以用丽春红染液进行转膜验证。丽春红带负电荷，可与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可与蛋白的非极性区相结合，形成红色的条带，判断转膜效率。丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水、PBS或其它适当溶液洗去。
Tips
1、用转膜缓冲液润洗凝胶，可去除残留的SDS，同时润洗的胶更容易与膜贴合，减少气泡；将PVDF膜慢慢贴胶上，可以用玻璃棒轻轻滚动，以驱赶残留的气泡，保证WB条带干净美观。
2、PVDF 膜使用前需用无水甲醇活化约 2min，再浸泡于转膜缓冲液待用。可以活化PVDF膜上的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。尽量避免用手直接接触 PVDF 膜，以免造成污染。
3、转膜优化方法
大分子蛋白转膜优化方法：
①对于分子量特别大的蛋白，延长转膜时间，建议转膜条件为300 mA，60-90 min或更长，亦可在转膜液中加入适量SDS至终浓度0.5‰左右，以加强蛋白从凝胶中的释放；
②转膜缓冲液中甲醇浓度降到10%或更低，有助于防止蛋白沉淀；
③用4℃湿转低电流过夜。
小分子蛋白转膜优化方法：
①SDS妨碍蛋白与膜的结合，可去除缓冲液中的SDS；
②对于常规中小分子量蛋白（25-70 kDa），可选用孔径0.45 μm的膜，转膜缓冲液中甲醇浓度20%，建议转膜条件为300 mA，30 min左右；
对于20 kDa以下小分子量蛋白，建议使用孔径更小的0.22 μm PVDF膜，转膜条件为200 mA，20-25 min或300 mA，15-20 min，亦可增加甲醇（可用乙醇替代）含量至25%以加强对凝胶里小分子蛋白的固定作用。
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01
购买链接：转印电泳仪（SVT-2）
特点
1.双板结构，可与SVE-2型电泳仪配套使用。
2.转印槽盒体一体注塑成型，耐腐蚀、透明度高、产品稳定。
3.转印夹正负极分明，提手功能，操作方便。
4.“S”卡槽设计，可使转印芯与槽体牢固组合，轻松拔盖。
5.转印效率高，转印时间约为20-40min。
6.结构材质稳定，可配合冰浴同步进行降温。
转印电泳仪
“S”卡槽设计
购买链接：电泳电源（PW-600）
特点
1.具备多种编程工作方式，高精度高可靠性;
2.超大液晶屏幕显示全部操作提示；
3.电压电流稳定，确保条带的美观性和可重复性；
4.具有自动报警及自动关机功能，有效避免实验仪器损坏。
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02
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100%纯棉滤纸，可耐受甲醇、乙醇及其他有机试剂。厚度有0.15 mm和0.6 mm两种，预裁切尺寸为7×9 cm。
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转膜海绵预裁切尺寸为7×9 cm，搭配转膜滤纸使用。
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分子量大于20 kDa的蛋白推荐选用孔径0.45 μm的膜，分子量小于20 kDa的蛋白推荐选用0.22 μm的膜。
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用于Western-Blot实验的湿法转膜。
粉末细腻，溶解迅速，方便使用。
主要组分为20 mM Tris，192 mM甘氨酸，pH 8.2-8.6@25℃。
本期关于转膜相关的要点我们就讲到这里啦。
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