前言:
个性化医疗保健可以通过高通量的核酸测序来挖掘变异,并总结个人或组织中与发病率和致病的差异分子来实现。肿瘤相关的转录组学是一个非常复杂的系统,与蛋白质、药物、代谢产物均相关的生物学过程。针对肿瘤基因组和转录组的数据挖掘,可以有效的筛选肿瘤生物标志物或治疗靶点的变异。
本案例以QIAGEN公司的IVA和IPA为工具针对肿瘤特异基因型和基因表达,挖掘肿瘤不同亚型的关键差异。针对乳腺癌的不同的亚型——快速转移的乳腺癌亚型型(Claudin-low)和慢速转移的乳腺癌亚型(luminal)进行测序并寻找与上皮细胞-间充质转化(EMT)相关的变异分析。EMT是一个复杂的去分化过程,是胚胎早期发育的关键。而发生EMT的肿瘤细胞侵略性更强,能侵袭远端的器官。
多数Claudin-low亚型为三阴型(ESR1,PGR,ErbB2)乳腺癌,预后较差,也没有有效的标志物;而luminal乳腺癌(包括A型与B型)预后良好。本案例主要挖掘导致EMT的关键因子,从两种亚型中分别选取了5个具有代表性的细胞系,并对其RNA-seq数据进行深度挖掘。使用IVA进行变异分析寻找到仅在Claudin-low亚型中出现,发生错义突变的HRAS基因。之后在IPA中再对其进行功能挖掘,发现在Claudin-low亚型中这一突变强烈的驱动了转移前转录活动,并且HRAS受转录因子SNAl1和TWIST、EMT的生物标志物MMP2(matrix metalloproteinase-)调节.
材料和方法
IVA变异筛选结果:
使用IVA可以根据不同条件设置,将获得的387662条变异一层一层过滤。最终能找出具有生物学意义的突变。
以上两个过滤能够将387662条变异,去除普通变异和遗传变异,寻找和癌症相关的EMT相关的变异,最后得出下图,找到HRAS基因变异。
得出HARS基因变异后,希望能对该基因进行网络和功能的探索,寻找更深一步的生物学挖掘。
IPA生物功能挖掘
IPA生成EMT相关基因网络,按照基因功能(形状)以及亚细胞定位作图(如下图)。而luminal乳腺癌与Claudin-low亚型乳腺癌对比的出基因的上下调,用红色表示上调,绿色表示下调。图中,红圈表示公认的肿瘤标记物,MMP2(上调),CDH1与CLDN3(下调),蓝色圆圈表示EMT关键转录因子(Snai1 / 2,Twist1,GSC,ZEB1/ 2)多数都是上调状态。图中实线表示与EMT相关的经典通路中参与的基因。
下图描绘与转移相关基因网络。图中显示出与HARS相关的基因连联系。虚线紫色高亮显示
HRAS和MMP2的关系。图中颜色表示luminal乳腺癌与Claudin-low亚型乳腺癌对比的出基因的上下调,用红色表示上调,绿色表示下调。可见HARS未有明显的变化。
在使用IPA时,可以认为的假定上调或下调某基因表达,预测与之联系的基因的表达。如下图所示,用IPA的MAP(分子活性预测)功能,假设上调HARS后,与之联系的MMP2基因也会高表达,而CDH1基因则处于抑制状态。而HARS上调,也对EMT相关的snail2,TWIST等基因有所影响。
如果寻找在Claudin-low亚型乳腺癌中的上游调节因子。找到具有激活作用的相关转录因子,很容易能看到TWIST1,SNAI1 ,SPDEF等EMT中常见的转录调节因子。将其与其作用的基因共同做出下图。可以看到许多与EMT相关的生物过程中的关键分子比如上调了RHOA, SNAI2, ZEB1,ZEB2, HIF1A等,下调了CDH1,CLDN4, OCLN等基因。
如果想看到上面的调节网路与HARS和CD44(多种肿瘤表面表达的糖蛋白受体)的关系,直接可用IPA的作图功能加入这个网络中,并创建与上面转录因子及其作用基因之间的关系,得出下图。如图可见:HARS收到上调影响,而图中CD44却收到一些下游影响。
如果深究SNAI1与其他转录因子的机制网络可以用IPA找到如下图的关系。可以看到SNAI1对转录调节因子MMP2有强烈的上调作用,而对CDH1有下调的作用。可以看到HARS在也存在于SNAI1主调节的网络中,并且对MMP2和CDH1的活性均有影响。
案例总括:
通过配合使用IVA和IPA,能够解释基因组(变异分析)和转录组(分子表达)数据。经对照分析luminal乳腺癌与Claudin-low亚型乳腺癌细胞系,找到HRAS变异,并确定出在Claudin-low亚型乳腺癌中,其参与了EMT的转录因子调控,并且找到一系列Claudin-low亚型乳腺癌相关的促转移基因。
IPA的预测计算功能能够找寻到影响EMT的机制网络以及关键的转录因子Twist1、Snai1 和MMP2因果网络活性。
在日常的分析中,很多基因产生成千上万的Isoform和多种可能关系,变异分析与功能分析的双重方法(IVA与IPA结合使用),能够识别可能的因果影响和关键Isoform。
每个预测的关系均有实验得出的证据支持。IVA与IPA采用的均为有各领域专家人工整理的的数据库,为所有与生物活动相关的预测结果提供准确的依据。
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