前言：
个性化医疗保健可以通过高通量的核酸测序来挖掘变异，并总结个人或组织中与发病率和致病的差异分子来实现。肿瘤相关的转录组学是一个非常复杂的系统，与蛋白质、药物、代谢产物均相关的生物学过程。针对肿瘤基因组和转录组的数据挖掘，可以有效的筛选肿瘤生物标志物或治疗靶点的变异。
本案例以QIAGEN公司的IVA和IPA为工具针对肿瘤特异基因型和基因表达，挖掘肿瘤不同亚型的关键差异。针对乳腺癌的不同的亚型——快速转移的乳腺癌亚型型（Claudin-low）和慢速转移的乳腺癌亚型（luminal）进行测序并寻找与上皮细胞-间充质转化（EMT）相关的变异分析。EMT是一个复杂的去分化过程，是胚胎早期发育的关键。而发生EMT的肿瘤细胞侵略性更强，能侵袭远端的器官。
多数Claudin-low亚型为三阴型（ESR1，PGR，ErbB2）乳腺癌，预后较差，也没有有效的标志物；而luminal乳腺癌（包括A型与B型）预后良好。本案例主要挖掘导致EMT的关键因子，从两种亚型中分别选取了5个具有代表性的细胞系，并对其RNA-seq数据进行深度挖掘。使用IVA进行变异分析寻找到仅在Claudin-low亚型中出现，发生错义突变的HRAS基因。之后在IPA中再对其进行功能挖掘，发现在Claudin-low亚型中这一突变强烈的驱动了转移前转录活动，并且HRAS受转录因子SNAl1和TWIST、EMT的生物标志物MMP2(matrix metalloproteinase-）调节.
材料和方法
IVA变异筛选结果：
使用IVA可以根据不同条件设置，将获得的387662条变异一层一层过滤。最终能找出具有生物学意义的突变。
以上两个过滤能够将387662条变异，去除普通变异和遗传变异，寻找和癌症相关的EMT相关的变异，最后得出下图，找到HRAS基因变异。
得出HARS基因变异后，希望能对该基因进行网络和功能的探索，寻找更深一步的生物学挖掘。
IPA生物功能挖掘
IPA生成EMT相关基因网络，按照基因功能（形状）以及亚细胞定位作图（如下图）。而luminal乳腺癌与Claudin-low亚型乳腺癌对比的出基因的上下调，用红色表示上调，绿色表示下调。图中，红圈表示公认的肿瘤标记物，MMP2（上调），CDH1与CLDN3（下调），蓝色圆圈表示EMT关键转录因子（Snai1 / 2，Twist1，GSC，ZEB1/ 2）多数都是上调状态。图中实线表示与EMT相关的经典通路中参与的基因。
下图描绘与转移相关基因网络。图中显示出与HARS相关的基因连联系。虚线紫色高亮显示
HRAS和MMP2的关系。图中颜色表示luminal乳腺癌与Claudin-low亚型乳腺癌对比的出基因的上下调，用红色表示上调，绿色表示下调。可见HARS未有明显的变化。
在使用IPA时，可以认为的假定上调或下调某基因表达，预测与之联系的基因的表达。如下图所示，用IPA的MAP（分子活性预测）功能，假设上调HARS后，与之联系的MMP2基因也会高表达，而CDH1基因则处于抑制状态。而HARS上调，也对EMT相关的snail2，TWIST等基因有所影响。
如果寻找在Claudin-low亚型乳腺癌中的上游调节因子。找到具有激活作用的相关转录因子，很容易能看到TWIST1，SNAI1 ，SPDEF等EMT中常见的转录调节因子。将其与其作用的基因共同做出下图。可以看到许多与EMT相关的生物过程中的关键分子比如上调了RHOA, SNAI2, ZEB1,ZEB2, HIF1A等，下调了CDH1,CLDN4, OCLN等基因。
如果想看到上面的调节网路与HARS和CD44（多种肿瘤表面表达的糖蛋白受体）的关系，直接可用IPA的作图功能加入这个网络中，并创建与上面转录因子及其作用基因之间的关系，得出下图。如图可见：HARS收到上调影响，而图中CD44却收到一些下游影响。
如果深究SNAI1与其他转录因子的机制网络可以用IPA找到如下图的关系。可以看到SNAI1对转录调节因子MMP2有强烈的上调作用，而对CDH1有下调的作用。可以看到HARS在也存在于SNAI1主调节的网络中，并且对MMP2和CDH1的活性均有影响。
案例总括：
通过配合使用IVA和IPA，能够解释基因组（变异分析）和转录组（分子表达）数据。经对照分析luminal乳腺癌与Claudin-low亚型乳腺癌细胞系，找到HRAS变异，并确定出在Claudin-low亚型乳腺癌中，其参与了EMT的转录因子调控，并且找到一系列Claudin-low亚型乳腺癌相关的促转移基因。
IPA的预测计算功能能够找寻到影响EMT的机制网络以及关键的转录因子Twist1、Snai1 和MMP2因果网络活性。
在日常的分析中，很多基因产生成千上万的Isoform和多种可能关系，变异分析与功能分析的双重方法（IVA与IPA结合使用），能够识别可能的因果影响和关键Isoform。
每个预测的关系均有实验得出的证据支持。IVA与IPA采用的均为有各领域专家人工整理的的数据库，为所有与生物活动相关的预测结果提供准确的依据。
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