胚胎视网膜祖细胞与视网膜移植_郑大中科博生

  

具中科博生研究表明，视网膜变性疾病在致盲和低视力中占主要地位。虽然它的发病机制各异，但最终都发生不可控的视网膜神经细胞破坏及功能丧失。胚胎视网膜由于发育未成熟，仍有生长能力且抗原性小，因而是移植的主要材料。移植的成分有所不同，可进行全层移植及单纯的感光细胞层移植。中科博生。

将分离的感光细胞层移植到没有臟光细胞层的成年鼠的视网膜下腔中，经过一定时间的发育后用电镜进行植片结构的检査，发现移植的感光细胞片与宿主的内核层之间形成了类似外丛状层结构，在形成的外丛状层结构中可见凹陷性突触结构，而在宿主的视网膜中没有这种结构，同时他们也发现光照移植眼后出现了 VEP及瞳孔的改变，证明了移植的感光细胞与宿主视网膜细胞形成了突触连接并有一定功能。中科博生。

另一些研究表明，移植的感光细胞形成了完整的内节和外节，突触终端内有突触带及许多小的突触小泡，与宿主的双极细胞及水平细胞形成了突触二联体及三联体，植片与宿主的视网膜间无特异性发现。在进行结构方面研究的同时，许多学者对移植后视网膜成分的发育情况进行了观察，把人的胚胎视网膜(孕后6〜11周)移植到成年鼠的视网膜下腔中，术后13〜37周内取眼球，用免疫组化技术对视网膜中各种细胞的生长情况进行了观察，结果视锥细胞在14〜16周时出现神经特异性烯醇酶及突触泡蛋白(synaptophysin, SYN) , 25周出现视蛋白；视杆细胞17〜18周表达S抗原，20周时胞体及内节出现转导蛋白及视紫红质，37周时视杆细胞内外节都表达很强的杆细胞特异性抗原。中科博生。

在移植的早期(总胎龄14〜16周)，胶质细胞就表达波形蛋白(vimentin), 19〜20周时植片放射状胶质细胞开始表达RALBP (cellularretinal dehydebinging protein) , 25周时达到最高程度，同时，植片开始表达胶质神经酸蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP) (Seiler 1992) 0 但将胚胎视网膜植入成年动物的视网膜下腔后，检査发现植片同正常视网膜一样都有玫瑰花结构存在，外节区域有视网膜样结合蛋白存在，说明移植的细胞可以合成分泌正常的细胞间质成分。而检査发现植片细胞中一氧化氮合成酶的存在，证明能够生成对视网膜有营养作用及递质作用的一氧化氮。移植细胞发育正常，表达细胞特异性标志，光感受器细胞表达视紫红质R2-15、免疫特异性锥细胞色素cos-1和cos-2,锥细胞表达特异性抗原50-1B11,双极细胞表达PKC,水平细胞表达HPC-1抗原及神经丝蛋白(neurofilament protein),胶质细胞表达GFAP和波形蛋白。

导入标志基因的胚胎视网膜移植到成年动物的视网膜下腔，经过一定时间的发育后，进行检测，植片视网膜仍能表达该标志基因的产物。组织学上植片细胞与宿主相邻的结构形成了正常关系。将单个电极放在移植的视网膜表面，然后检査记录到局部视网膜电图及短暂on或on-off反应，则感受野的大小与刺激光强度有关，刺激光强度越高视网膜组织感受野的反应也越大，波形有时表现0n-center反应，有时on-off反应。局部视网膜电图是去极化反应的记忆，或者是正常视网膜反应中看到的M波，反应植片中无长突细胞的电位活动，这些电位变化大致与正常视网膜的电活动一致。中科博生。

治疗性视网膜细胞移植是基于这些细胞能对受体视网膜细胞起到营养作用，并能恢复视网膜细胞的数量。业巳证实，移植的胚胎组织得到与胎龄相一致的发育，并保持了器官、形态和功能的分化。受体免疫系统监视（immunologicsurveillance）成为胚胎组织移植是否成活的关键，无论是异种还是同种视网膜移植，眼防御免疫监视的屏蔽特性促进了植片的成活，这些在哺乳动物（如鼠、兔、灵长类）和人的视网膜移植时得到证实。中科博生。

供体的胎龄对移植成功起主要作用。通过实验确定最适胎龄：大鼠为15~16d；兔为15〜16d,人6〜11周，允许到18周。采用供体细胞的新鲜悬液效果最好，冷冻保存后效果稍差。由于在胚胎期可能有视网膜感染，这就必须检査供体视网膜的感染性疾病，还必须排除遗传性视网膜和神经系统疾病、遗传性代谢疾病，因为它们能影响植片的分化及发育过程。中科博生。

目前有两种观点：一些研究者倾向于移植培养的分离细胞（色素上皮细胞、感光细胞），这样可使植片致敏力达到最小；另一些研究者则主张移植复合细胞，认为可以提高成活率和细胞的分化。移植早期的胚胎细胞是合理的，因为在胚发育的最早期，移植的成神经细胞能继续分化成所有的视网膜细胞结构成分、并且致敏性最弱。中科博生。

移植术后，最大限度地保存受体眼解剖结构的完整，对于移植成活具有非重要的意义，这就要求确定手术方法。有两种通路到视网膜下腔（经玻璃体和巩膜）。后部经巩膜通路，会破坏脉络膜血管和Bruch膜，导致血-眼屏障的破坏和受体的早期致敏。经玻璃体通路，血、眼屏障的解剖结构没有破坏，且术野清晰。中科博生。

观察胚胎视网膜在受体的形态、分化和功能，是研究治庁性移植的重要阶段。为了研究移植细胞的结局，在移植前做了荧光和放射指示剂。移植后显示，供体视网膜胚胎细胞在视网膜下腔继续分裂，分化出与胎龄相适应的形态和组织化学特征。形成特征性的玫瑰花状球形细胞团。感光细胞位于其内，其外是双极细胞、放射状胶质细胞和无长突细胞。感光细胞最早分化，一般在接近发育的20周时完成，其他细胞分化较迟。在移植色素上皮细胞时，显示形成了典型的组织学结构，供体的色素。上皮细胞同受体的感光细胞建立了联系，并发现色素上皮细胞外节的吞噬作用。中科博生。

电子显微镜检査证实，玫瑰花形细胞团的感光细胞与双极细胞形成视网膜的典型突触连接，轴突从细胞团的内丛状层走向受体视网膜的外丛状层，形成功能性交触。玫瑰花形细胞团的双极细胞也能同受体视网膜的神经节细胞形成突触连接。中科博生。

移植的细胞在视网膜只有典型的机能。在先天性视网膜变性的盲鼠，移植胚胎视网膜后2〜3个月，出现瞳孔对光反射。在应答光刺激时，移植细胞的突触间隙发现释放的介质、这些介质具有儿茶酚胺介质系统的某些功能特性，并与突触连接的分布有关。中科博生。

视网膜移植后的电生理研究发现，出现典型的ERG电位，在先天性视网膜变性的大鼠86%恢复正常的ERG。对盲鼠的视网膜移植区给予光刺激，可在外侧膝状体和视皮质相对应部位记录到同步的电信号。中科博生。

视网膜移植有副作用和并发症。最严重的并发症是植片脱落，脱落最多见于使用异种移植和成年供体。在异种移植，移植1〜3个月间，迟发致敏可使植片脱落，并形成自身抗视网膜抗体。在同种移植，成年受体在移植3~6个月间发现受体致敏，伴有植片脱落和明显的自身视网膜损伤。这就要求对受体的免疫监视不只是在移植的早期，而要做长期观察，可应用环抱素A预防免疫排斥反应。中科博生。

当发生免疫并发症时可通过激光凝固消除根片。研究表明胚胎视网膜包含着在体外具有干细胞分化潜能的祖代细胞，这些细胞除了可增殖并表达神经外胚层标记外，还具有多向分化潜能，如在特定条件下它还可以分化成光感受器细胞。中科博生。

这说明此祖代细胞可以用于细胞移植治疗视网膜疾病。他们接下来又证明了体外培养的视网膜祖代细胞视网膜下移植到眼底后可存活并分化，对原视网膜的结构毫无影响。他们釆用的方法没有形成玫瑰花结，移植的祖细胞还表达了光感受器细胞特有的标记，这说明视网膜祖细胞具有分化成感受器细胞的能力。中科博生。

一系列工作证明了视网膜祖细胞作为移植共体的可能性。但祖细胞的移植是否能够帮助修复受损的视网膜及受损的视网膜如果被修复是否伴随着视功能的恢复等问题目前还没有答案。

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