有过国自然申请经验的科研人,有可能会收到诸如“需设计严谨的Rescue实验”的专家反馈意见。Rescue实验即挽救实验,挽救实验是高分文章、国自然研究方案的必备环节。有很多初入门的科研人对于挽救实验不太了解,今天我们就为大家详细解析一下。Rescue实验是机制研究的主要设计,是机制研究必不可少的一部分。Rescue,顾名思义即为“挽救”,也就是我们的研究中某一个现象发生了变化,我们需要将该变化挽救回来。在同一个条件下先正向再反向,或者先反向再正向观察表型的得而复失或者失而复得,这种实验就叫 Rescue。Rescue 能够很好排除现象背后的假阳性本质,建立可靠的因果逻辑。根据挽救的现象,我们把Rescue实验分为表型挽救和机制挽救。表型挽救是说A技术回复了B技术所造成的表型,比如X基因的过表达回复了X基因的干扰所造成的表型,这里说的表型比如细胞增殖表型、周期、自噬等等;机制挽救是说A技术回复了B技术所造成的下游分子表达、活性或者定位,比如X基因的过表达回复了X基因的干扰所造成Y基因的上调,P通路的激活,或者Z分子的定位。
根据要解决的问题,我们把Rescue实验分为分为单因素挽救和多因素挽救。
单因素挽救是指围绕单一因素展开的A技术和B技术的回复,X基因的过表达回复了X基因的干扰所造成的表型和表达调控,就是围绕X基因所展开的表达层次的回复。广义来说,这里的单因素除了基因外,还可以是信号通路(比如通过对TGF-β通路进行激活和抑制挽救细胞纤维化的表型)、表型(比如通过促进和抑制细胞自噬研究自噬对肿瘤的影响)、菌群(比如通过菌群移植挽救菌群缺失造成的IBD) ,甚至是药物。
多因素挽救就复杂一些了,我们以两因素为例,比如为了证明M分子通过调控N分子的表达影响细胞增殖,就可以通过干预M分子挽救N分子干预所造成的细胞增殖能力变化来证明。多因素挽救实验是研究分子间调控关系常做的实验之一。
Rescue的一个核心逻辑,就是把中间传递那个环节,让他不调节,然后看上面那个因,是否还会影响到串联因果后面的果。我们在文献里面,看到单因素操作的时候,基本上脑子都不会乱,就是因为操作一个因素,你能看到的结果,基本上都是阳性结果,而Rescue实验,是一种典型的双因素操作实验,就是操作因素的同时,我要逆转一个中间的环节,然后去看效应是否被回复回来了。在Rescue实验中,分子间的调控趋势与上游分子的操作方向决定了下游分子应该怎么操作,可总结为这十二字真言:正正反,正反正;反正正,反反反。其中第一个字的正反是两个分子之间的调控关系,第二个字正反代表上游分子操作手段(过表达还是沉默),而第三个字正反是下游分子的操作手段。
“正正反,正反正”指的是当上下游是正向调控关系时,过表达上游则Rescue应该抑制下游;沉默上游则Rescue应该过表达下游。而“反正正,反反反”则指的是当上下游是负向调控关系时,过表达上游则Rescue应过表达下游;沉默上游则Rescue下游也沉默。