D1分子,虽然表达不很高(由于IL-4的加入降低了它们的表达),但仍能证明培养出来的就是DCs。
图1 哮喘小鼠骨髓DC培养至第2天的细胞集落
图2 哮喘小鼠骨髓DC培养至第4天的细胞集落
图3 哮喘小鼠骨髓DC培养至第7天的细胞
表1 哮喘模型鼠与正常对照鼠DC表面共刺激分子表达的百分数 (x±s,%)
注:n=3(3复孔的均数),与对照组相比,* P <0.05
图4 流式细胞仪分析图形
022、043、027、024为哮喘组DC017、038、037、019为对照组DC
图5 哮喘组和对照组DC表型比较
2.3 两组DC刺激同种异体T细胞增殖能力的分析 结果显示哮喘组DC和对照组DC均能刺激同种异体的T细胞的强烈增殖,且随DC数目的增多而增强;而且哮喘小鼠DC比对照小鼠DC刺激同种异体的T淋巴细 胞增殖的能力明显增强,表明哮喘小鼠DC有更强的抗原递呈能力,如表2和图6所示。对同一组小鼠不同DC浓度刺激T淋巴细胞增殖能力比较发现,同在哮喘小 鼠中不同DC浓度刺激T细胞增殖的能力也不同,如图7所示。而在对照小鼠中,不同浓度的DC刺激T细胞增殖的能力没有明显差异性(
P >0.05)。
表2 哮喘组和对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的比较 (x±s)
注: n =3,与对照组相比,☆ P <0.001,△ P <0.01,* P <0.05
图6 不同DC数目刺激同种异体T细胞增殖的比较
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图7 在哮喘组中不同浓度DC刺激T淋巴细胞增殖的比较
注:※ P <0.01,* P <0.05
3 讨论
DC在体内的含量很少,在血液中仅占单个核细胞总数的0.5%~1.0%,且表面缺乏特征性标志,难以与其他细胞分离纯化,因此,直接从外周血或脾脏中分 离不仅操作复杂,而且细胞得率很低,很难满足实验中的大量需要。体外诱导扩增DCs的方法很多。自从Inaba[5]用rmGM-CSF体外诱导扩增小鼠 骨髓DC以来,人们逐步建立并完善了多种培养扩增DC的方法。如从脐带血、外周血干细胞、外周血单核细胞中诱导分化出DC。尽管不同的前体细胞扩增DC的 方法各不相同,但GM-CSF是必不可少的。GM-CSF可以诱导DC前体增殖分化,并可在体外维持DC的存活。IL-4往往与GM-CSF同时使用,特 别是从外周血单核细胞诱导DC时,IL-4可抑制巨噬细胞增生,而有利于向DC分化。但DC的鉴定没有特异的分子标志,若鉴定所得细胞为DC,往往根据形 态学、组合型标志和混合淋巴反应刺激同种异体的T细胞增殖这3个方面来判断。除了具有许多树突样的突起这一典型的特征外,其表面还高表达MHCⅡ类分子、 共刺激分子和黏附分子如CD40、CD86、CD80、ICAM等;能迁移至引流淋巴结刺激初始T细胞的活化增殖,具有这些特征的细胞方能称之为 DC[6]。目前,有一些DC特异的表面标志已经得到公认[7],如小鼠表面的33D1和NLDC145,大鼠的OX62及人DC表面的CD1a和 CD83。本研究获得的细胞在显微镜下呈现大小不一的树突,而且流式细胞分析也检测到了小鼠DC特异的表面标志——33D1和DC相关的分化抗 原:CD40、CD80、CD86;最后我们发现所诱导扩增的两组小鼠DC可以强烈刺激同种异体的T淋巴细胞的增殖,并且随着刺激细胞数目的增多而增强。 因而,从这3个方面我们可以认定所培养出来的细胞正是DCs。
DC提供了抗原特异T细胞活化、增殖的两个信号。DC在肺表面和气道上皮形成强大的防御网络,可以识别、加工、处理和递呈吸入的抗原,提供抗原信号,形成 抗原肽-MHC复合物向引流淋巴结迁移,在迁移过程中,DC表达上调表面共刺激分子CD40、CD86、CD80等,这些分子可以与T细胞表面的CD28 结合,形成CD80/CD86-CD28共刺激信号通路,提供了抗原特异的T细胞活化所必需的第二信号,从而启动了初始T细胞的活化。因此认为气道DC在 诱导初始型T细胞对吸入抗原的初次免疫反应和过敏反应中起重要作用,是始动气道变态反应之必需[8]。
目前已经知道哮喘的效应细胞是CD4+T细胞,特别是Th2细胞。DC是唯一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞,并使其向Th2细胞分化的过程中起重要作 用[9]。通过表面共刺激分子的表达来启动Th细胞活化并影响其向Th2细胞的分化和功能。当共刺激信号缺乏时,会导致T细胞反应无能。 CD80/CD86-CD28信号通路与过敏性哮喘中的关系已在一些实验中得到证实。研究发现,T细胞表面分子CD80、CD86的配体CD28缺乏时, 气道内DC不能诱导Th2反应[10]。阻断CD80/CD86与配体CD28的相互作用,可抑制Th2类细胞因子基因的表达[11]。在小鼠气道炎症模 型中减轻小鼠的气道炎症,降低支气管灌洗液中嗜酸粒细胞数量及IL-5、IL-4的含量[12]。在哮喘患者支气管灌洗液中发现,T细胞的活化增殖和 IL-5产生依赖于CD86[13]。这些都表明CD86在哮喘发生中的重要作用,依赖于CD86启动初始T细胞的活化,并且诱导Th细胞向Th2细胞分 化,促进IL-5的产生,诱发Eos增多的气道炎症。本研究中,哮喘小鼠骨髓DC表达CD86分子水平较对照鼠有明显升高( P <0.05), 进一步证实了DC可以通过其表面的共刺激分子CD86影响Th2细胞分化。CD80主要诱导Th1分化,但对Th2分化也有一定的影响,对抗原所致的炎症 有维持和增强作用。Cheng等[11]用OVA致敏BALB/C小鼠建立哮喘模型研究脾脏来源的DC的表型发现,哮喘组CD80的表达明显上调,而 CD86则没有差异。但在本实验中却未见CD80在两组小鼠DC中有差异,表明了DC的异质性,不同来源DC可能存在功能上的差异,也提示可能在哮喘的不 同阶段,CD86和CD80起着不同的作用。DC表面的CD40可以和T细胞表面的CD40L结合,促进T细胞自身的活化,导致IL-12的产生,而 IL-12则可以促进Th1细胞的分化。本研究结果提示,CD40在两组中并未见差异,这值得进一步探讨。
混合淋巴细胞反应即T淋巴细胞的活化增殖反应。这种现象的存在是由于MHC抗原有很强的免疫原性,无论是Ⅰ类还是Ⅱ类抗原,都能在体外直接诱导出强烈的初 次T淋巴细胞免疫应答。DC对T淋巴细胞作用的强度与其表面共刺激分子的表达有关。共刺激分子的表达越高,对T细胞的刺激能力越强[14]。本实验结果显 示,哮喘小鼠DC和对照组小鼠DC均能诱导同种异体的T淋巴细胞增殖,且随DC数目的增多增殖能力增强。哮喘小鼠DC刺激T细胞增殖明显高于对照组小鼠, 表明哮喘小鼠DC的抗原递呈能力明显强于对照组。在哮喘小鼠中随DC数量的增加增殖能力也明显增强,表明DC数量存在差异时,其功能也存在差异,数量多则 功能强,数量少则功能弱。
本研究发现,哮喘小鼠骨髓DC表面CD86分子表达增加的同时,其刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力也明显增强,表明了哮喘小鼠DC可能通过其表面刺激分 子CD86的差异表达,从而增强了抗原递呈能力,导致了T细胞的过度活化,特别是向Th2细胞的活化,导致气道炎症。但DC在诱导Th细胞分化过程中可能 受许多因素的影响,DC诱导哮喘炎症的机制值得进一步研究。
【参考文献】
1 Cheng X,Wang C,Qian G,et al. CD80,but not CD86 were upregulated on the spleen-derived dendritic cells from OVAsensitized and challenged BALB/c mice. Immunol Lett,2003,89(1):31-38.
2 Radhakrishnan S,Iijima K,Kobayashi T,et al. Dendritic cells activated by crosslinking B7-DC (PD-L2) block inflammatory airway disease. J Allergy Clin Immunol,2005,116(3):668-674.
3 陈欣,林涛,周童亮,等.雾化吸入白细胞介素-12对小鼠哮喘模型气道炎症和辅助T细胞亚群的影响.中华内科杂志,2002,41:313-316.
4 丁传林,姚堃,张天泰,等.IL-4对DC产生IL-12影响的研究.上海免疫学杂志,2003,23:248-251.
5 Inaba K,Inaba M,Romani N,et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures suppl[来源:论文天下论文网 lunwentianxia.com]