【摘要】目的探讨靶向肝癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)-3的纳米探针AgS@BSA-TJ12P1在近红外二区 (NIR-II)荧光成像早期诊断肝癌转移灶中的优势。方法﹐制备硫化银纳米探针 AgS@BSA-TJ12P1。通过体外细胞实验验证CPC-3表达,检测各肝癌细胞系转移能力。采用激光共聚焦成像验证硫化银纳米探针选择性摄取至肝癌细胞系情况。采用肝癌高转移细胞系建立裸鼠肝癌原位转移模型,通过NIR-II在体成像观察微小转移灶。结果 Ag;S@BSA-TJ12P1被激发后,可在 1080nm处发出NIR-Ⅱ荧光。细胞实验显示,肝癌GPC-3在肝癌细胞系中均有高表达,AgS@BSA-TJ12PI可被HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3细胞特异性摄取。近红外二区NIR-II荧光成像系统对裸鼠微小转移灶作出早期诊断。
肝癌是全球第5大常见恶性肿瘤,外科肝切除术是首选治疗方法,然而目前术后复发率高。肝肿瘤周边伴有微转移灶,肉眼难以识别,为手术彻底切除病灶带来一定困难。近年实时光学手术导航技术发展为此带来新机遇,近红外二区(second near-infrared region , NIR II )荧光成像较传统近NIR-I成像穿透度更深、分辨率更高、自发荧光更少,故可极大提高术中成像灵敏度。
以肝癌高表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican,GPC)-3为靶点,通过特异性靶向多肽与荧光探针相偶联,可大大提高荧光探针主，动靶向肝癌的能力。本研究通过构建靶向肝癌GPC-3特异性NIR-II荧光探针、肝癌裸鼠转移模型并在体观测NIR-II荧光区,探讨NIR-II成像对肝癌微小转移灶早期诊断的优势。
TEM显示AgzS@BSA-TJ12P1纳米探针表征为量子点,粒径约为10nm(图1①);经多肽修饰后,吸收光谱可见400nm左右处有--特征性吸收峰,证明多肽与AgS成功偶联(图1②);NIR-II荧光光谱可见最大发射峰位于波长1 080 nm处,处于NIR-II谱段(图1③);IRDye-800CW作为NIR-I对照,采用不同厚度冻鸡胸肉遮盖样品并测试荧光穿透深度显示,NIR-II荧光较NIR-I荧光具有更强的穿透深度(6mm对9 mm)(图1④)。
(图2①)。Cy -5染料标记纳米探针AgS@BSA -TJ12P1并与4种细胞共孵育后,激光共聚焦成像可见纳米探针被HepG2,MHCC97-H,HCC-LM3细胞特异性摄取,而LO2细胞几乎不摄取(图2②)。
裸鼠注射纳米探针后1、2.6、12、24、48 h成像显示，探针首先富集于肝脏区域,12h后探针信号对转移灶具有最佳信噪比,48 h后信号基本消失(图3①);离体肝脏可见数枚直径约1 mm微小转移灶,散在分布于肝表面(图3②);苏木精-伊红(HE)染色组织病理切片可见病灶内大量异形细胞(图3③)。
综上所述,本研究结果在肝癌转移灶精准诊断及荧光手术导航方面具有一定的转化前景。但本研究也有局限性,所应用的裸鼠肝癌转移模型模拟肝癌血行转移病理情况,可能较人类肝癌肝内转移位置及特性存有一定差异,需要结合更多疾病动物模型加以验证,以及进一步优化靶器官成像时间窗等加以探讨。
作者单位:510080广州广东省人民医院(广东省医学科学院)、广东省心血管病研究所肿瘤中心介人治疗科
通信作者:陆骊工E-mail: luligong1969@126.com
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4、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；
5、能够实现近红外二区与彩色可见光的实时同步成像，且精确融合图像能够实时展示。
6、近红外二区成像具备过曝光预警功能。成像窗宽窗位可手动自由调节。且具备灰度图像自动增强功能。
7、可见光成像部分具备自动增益，自动曝光，自动白平衡功能，能够自动进行伽马矫正。融合算法先进，用户可以根据需求确定近红外与可见光融合的有效阈值。
8、红外图像、可见光图像和二者融合图像可以同时显示。拍照和录像数据可一键采集，且拍照和录像保存后可再次进行后续数据分析并不失融合。
9、成像参数与激光激发参数能够自动保存。
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1、荧光激发光源采用两种波长激光光源（808nm, 980 nm），功率可调且总功率≥20瓦；
2、每种荧光激发光源各采用两根液芯匀光光纤，分布两侧，保证无死角照射。
3、每根光纤末端配备准直器，可调整荧光激发光的均匀照射。
4、可通过系统软件实现激光控制。
5、激光参数自动保存在成像参数中。
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1、标配软件具备成像参数设置功能，如曝光时间、增益、相机工作温度、内外触发等，具备红外成像窗宽/窗位手动和自动调节功能；
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3、能够实现100μs寿命材料的荧光寿命成像；
4、可同时装载至少5个发射光滤片，标配滤片数量不少于4个；
5、具备荧光寿命成像专用软件模块，可通过软件调节激发光照明时间、相机曝光时间和激发光与相机曝光间隔时间，具有延时成像能力；
6、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差在10μs以内；
7、具备5通道以上小动物气体麻醉功能；
8、能够实现小鼠全身成像和局部成像，视野范围可调，最大视野范围不小于10cm x 8cm；
9、动物载物台可电控升降，行程不小于50cm；
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应用：
适合从事生物学、医学、天文学等科研工作者，特别适用于生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、天文成像和激光光斑分析等多种科研领域及军事、高端安防等应用领域。
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