别人的膀胱癌ceRNA如何做出新花样?

Identification of a potentially functional circRNA–miRNA–mRNA regulatory network for investigating pathogenesis and providing possible biomarkers of bladder cancer

识别一个潜在功能的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，用于研究膀胱癌的发病机制并提供可能的生物标记物

一.研究背景

近年来越来越多证据表面circRNAs参与到癌症的发生和演进过程，加之针对ceRNA机制的研究火热，所以作者想要研究在膀胱癌(bladder cancer，BCa)的发生演进过程中有哪些circRNAs在起作用，并有着怎样的ceRNA机制。想要通过建立全新的与BCa相关的ceRNA网络，为BCa的治疗提供新的靶点和标志分子。

二.研究思路

三.结果解析

1. 识别BCa中差异表达的CircRNAs(DECs)，miRNA，mRNA

图1.获取差异表达的circRNAs

        图1：从芯片数据集GSE92675中获得circRNAs的表达谱，样本为4对配对的BCa组织和癌旁正常组织。用Limma包分析，表达量经标准化后再log10处理。经过差异分析后一共识别出428个DECs(adjp<0.01)，其中有261个表达上调的DECs,167个表达下调的DECs，根据adjp值对DECs进行排序，最后取到了21个表达上调的DECs和28个表达下调的DECs。A图是表达矩阵的PCA分析图，BCa和对照组分的很开，说明存在明显的差异circRNAs。

图2.获取差异表达的miRNA与预测的靶miRNA取交集

• A-B：利用TCGA-BLCA数据库中的miRNA，mRNA测序数据(411BCa vs 19正常组织)，筛选出在BCa中差异表达的miRNA。得到在BCa中表达上调的miRNA50个，表达下调的miRNA22个。

• C-D：用CSCD网站(cancer-specific circRNA database)预测能与筛选出的DECs结合的miRNA，一共得到1861个靶miRNA。将预测的靶miRNA和BCa中的差异表达的miRNA取交集，最终选定28个靶miRNA。

图3.获取差异表达的mRNA与预测的靶mRNA取交集

• A-B:用相同的方法和标准分析TCGA-BLCA数据库中的mRNA测序数据，得到在BCa中表达上调的mRNA2694个，表达下调的mRNA1574个。

• C-D：在三个在线分析网站miRanda，TargetScan和PITA预测28个靶miRNA的目标mRNA，共得到3835个靶mRNA。将预测的靶mRNA和BCa中差异表达的mRNA取交集，最终选定476个靶mRNA。

图4. 靶mRNA的GO/KEGG功能通路分析

• A-B:对476个靶mRNA所代表的基因进行GO功能分析和KEGG通路分析，发现这些基因在MAPK和PI3K-AKT通路显著富集。

2. 构建BCa中的circRNA-miRNA-mRNA网络

图5.DECs的circRNA-miRNA-mRNA调控网络

• 根据筛选到的21个DECs，28个靶miRNA，476个靶mRNA建立了DECs的circRNA-miRNA-mRNA调控网络即ceRNA网络，并用cytoscape可视化。

3. 提取ceRNA网络中的核心DECs并验证

图6. ceRNA网络中9个核心DECs的表达情况

• 使用Cytoscape里的cytoHubbaplugin应用计算上文建立的ceRNA网络中各结点的degree value，并据此识别出几个作为中心结点的DECs。这9个DEGs在GSE92675数据集样本中表达情况用热图展示。其中

• 表达上调的DECs有：hsa_circ_0001955，hsa_circ_0032821，hsa_circ_0060219，hsa_circ_0011385，hsa_circ_0084171

• 表达下调的DEGs有：hsa_circ_0040039，hsa_circ_0082582，hsa_circ_0009172，hsa_circ_0077526

图7. hsa_circ_0011385表达量以及结构模式图 

• 用Primer Premier5软件对这9个circRNA构建特异的引物，在16对配对的BCa组织和癌旁正常组织样本进行qRT-PCR实验，检验这几个circRNAs在作者自己的样本中是否也有差异表达。

• A：hsa_circ_0011385在作者自己的样本中表达量的小提琴图，可以看到在BCa中，该DEC表达量显著降低。其它8个DECs因在样本中无法测出显著差异而未展示。

• B：hsa_circ_0011385的结构图。红色点是miRNA反应原件，蓝色点是RNA结合蛋白结合位点。

4.构建ceRNA的子网络

图8.  围绕hsa_circ_0011385建立的ceRNA子网

• 从前文选出的靶miRNA中有4个Hsa_circ_0011385的靶miRNA(mir-211-5p，mir-204-5p，mir-182-5p，mir-96-5p)。结合前文靶mRNA中确认的这4个miRNA的靶mRNA，作者构建了Hsa_circ_0011385的子网络，并用cytoscape可视化。

5.miRNA表达量验证以及临床关系研究

图9. miRNA表达量验证以及临床数据关系研究

• A-D-G-J：子网络中的4个miRNA在自己样本中的表达量用于验证是有否显著差异，只有mir-204-5p在BCa中表达量有显著的下调(p<0.05)，其它三个miRNA在组织中的差异表达并无统计学意义。

• B-E-H-K：4个miRNA的表达量在高低等级BCa样本中的表达情况，除了mir-96-5p外，其余三个miRNA的表达量在不同等级的样本间都存在显著差异。

• X-F-I-L：4个miRNA的表达量在TCGA-BLCA不同分期的样本中的表达情况，4个miRNA的表达量在Ⅰ期和Ⅳ期间存在着显著的差异。

• M：对TCGA-BLCA队列根据mir-204-5p的表达量进行了生存分析

• N：hsa_circ_0011385和miR-204的表达量呈负相关(r = − 0.43, P = 0.01268)，这也符合它们之间的ceRNA机制。

6.建立PPI网络并识别出核心基因

图10. PPI网络

• A：根据围绕Hsa_circ_0011385的ceRNA子网络中的靶mRNA对应的基因建立的PPI网络(蛋白质相互作用网络)。一共有67个结点和274个边。

• B：使用cytoscape中的MCODE插件对PPI进行分析，得到的18个核心基因构建的PPI网络。

7.对核心基因进行GO功能分析以及KEGG通路分析

图11. 核心基因的GO/KEGG分析结果

• A：18个核心基因的GO分析结果

• B：18个核心基因的KEGG分析结果

        到这里本篇文章的分析就结束了，我们最后总结一下吧。作者研究的是膀胱癌中的ceRNA机制，首先从GEO数据库中筛选DECs；从TCGA数据库中筛选DEmiRNA和DEmRNA，结合四个分析网站的预测结果，得到了最初的ceRNA网络，并对其靶mRNA进行了GO/KEGG分析。接着使用cytoHubba分析找到了网络中的核心DECs，构建了其中一个DEC的ceRNA子网络。根据子网络的靶mRNA构建PPI网络并用MCODE算法找到了核心基因，最后加上GO和KEGG分析就完成了本文的大体框架。再结合TCGA-BLCA的临床信息和自己的样本，做一些表达量验证，相关性分析，生存分析等细节就完成本文啦！怎么样，看完是不是想马上动手试一试，3+就是这么简单。