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Genome-wide Analysis of the Alternative Splicing Profiles Revealed Novel Prognostic Index for Kidney Renal Cell Clear Cell Carcinoma

选择性剪接图谱的全基因组分析解释了肾透明细胞癌的新的预后指标

一、 研究背景

到目前为止，进展期的肾细胞癌（RCC）由于肿瘤脉管系统对放疗和化疗的耐药，导致RCC仍然无法治愈，预后不良。选择性剪接（AS）可以大大增加蛋白质的多样性。越来越多的证据提示AS畸变是人类癌症发生发展的重要步骤。过往的研究提示AS的干扰对RCC的生长和侵袭发挥作用。因此作者创新性地分别从AS和剪接因子（SF）为RCC患者的预后分层提供新的方法；并通过构建AS和SF的调控网络，努力理解AS和SF对KIRC患者预后的相互作用机制。

二、 分析流程

三、 结果解读

1. 单变量Cox回归分析中与预后相关的AS事件

仅将符合条件的标准AS事件的纳入实验。作者对KIRC的AS事件进行单因素Cox回归分析得到与预后有关的AS事件。使用R的UpSet包绘制Upset图。

• Table1：展示了468位KIRC患者的样本的具体信息

• 1A：在KIRC的样本中，AS的7种事件的分布图。可见对于所有的KIRC样本，外显子跳跃（ES）是AS事件亚型中最主要的剪接类型。

• 1B：单因素Cox回归分析展示KIRC中的与预后有关的AS事件。

• 2：Upset图展示KIRC中与生存相关的AS事件之间的相互关系。从中可以发现：单个基因可能有多达4个预后相关的AS事件。

Table1：468位KIRC患者的详细的临床信息

图1：KIRC所有的AS事件和与预后相关的AS事件

图2：与生存相关的AS事件的UpSet图。

2. 预后相关的AS事件基因的蛋白质间相互作用（PPI）网络和通路注释

作者使用在线程序STRING，对KIRC的1000个预后相关基因创建PPI网络，网络中连接度最高的基因被定义为中心基因。使用R的ClusterProfiler软件包对上述的基因进行KEGG通路分析。

• 3：PPI网络展示了KIRC中前1000个预后相关AS事件的相互作用。其中心基因是：HERC2，UBE3A，UBA1，SIAH1和RPS9。

• Table2：KEGG注释数据，详细记录了KIRC中前1000个预后相关的AS事件的基因富集：可以看到这些基因组合而成的通路富集信息。

• 4：KEGG富集的圆形图和点图。A中右半圈中不同颜色的色带代表了前12条显著的KEGG通路，左半圈列出的基因则富集了这12条通路。可见最热门的三个通路是：单纯疱疹感染，核糖体和自噬-其他。

图3：与预后相关的前1000个AS事件的基因的PPI网络图

Table2：与预后相关的前1000个AS事件的KEGG注释

图4：KEGG富集的圆形图和点图

3. 建立预后指标（PI）模型

作者对来自KICH，KIRP type1和KIRP type2中每个剪接类型的前10个与预后相关的AS事件以及KIRC中每个剪接类型的与预后相关的前50个AS事件在SPSS中进行多元Cox回归，确定适合构建预测模型的AS事件。使用GraphpadPrism进行KM生存分析，用R的SurvivorROC包绘制tROC曲线。

• Table3：对KIRC预后相关的AS事件进行多元Cox回归分析后，用于PI模型构成的事件的数据陈列。

• 5：KIRC的8个PI模型的KM生存分析绘图。根据AS事件的PSI中位数进行分组。总体而言，除了PI-AP（C）之外，KIRC的PI模型具有令人满意的风险分层能力。

• 6：tROC：进一步肯定了KIRC的PI模型的效率。有3个PI的AUC值分别超过0.8，其中PI-ALL的AUC值最大=0.875

• 7：KIRC患者早期和晚期分组，根据PI-ALL模型进行KM生存分析。作者分别对KIRC患者的I，II和III，IV患者分组，可以看出，PI-ALL在区分患者高风险和低风险的能力，在早期和晚期RCC患者中都很出色。

Table3：KIRC预后相关的AS事件的多因素Cox回归分析

图5：KIRC的8个PI的生存分析绘图。

图6：tROC曲线评估KIRC中8个PI的预测效率

图7：KM生存分析评估PI-ALL在KIRC患者早期或晚期临床阶段的预后价值

4. SF和预后相关的AS事件的调控网络

        作者从SpliceAid2中获得了66个剪接因子（SF）的信息，通过单变量Cox回归分析获得12个预后相关的SF，对此进行KM生存分析。从中选出3个SF用于SF-PI的构建，并对此PI模型进行验证。

        接下来作者将这12个SF与AS事件进行皮尔森相关分析，使用Cytoscape进行绘图。

• Table4：单因素COX分析得到的12个预后相关的SF的数据.

• 8：KIRC的预后有关的SF的生存分析绘图：发现SF的表达可以较好的区分患者的预后。

• 9A：12个显著的预后相关SFpo的HR值。可见：多数SF的表达与KIRC患者的良好预后有关。（HR<1）

• 9B和C：从12个预后相关的SF中，通过多变量COX回归分析中选择了三个SF（PCBP1,KHDRBS3 和HTRA2）用于SF-PI的构建，通过KM生存分析（B）和tROC（C）表现出中等水平的预后分层能力。

• 10：KIRC的剪接调控网络。

Table4：单因素Cox回归分析得到的12个预后相关的SF

图8：KIRC中与预后相关的SF的KM生存分析图

图9：12个预后相关SF的HR值、基于SF的PI模型的KM生存分析图和tROC

图10：KIRC中的剪接调控网络

5. KHDRBS3的免疫组织化学（IHC）

    KHDRBS3是预后相关的SF之一。

• 11：十对KIRC和癌旁组织中KHDRBS3的免疫染色图像。可见：KHDRBS3主要在KIRC患者的细胞质中表达。

图11：十对KIRC和癌旁组织中KHDRBS3的IHC

小结

        在研究中，作者通过对KIRC中AS事件的单因素和多元Cox回归分析，构建了基于预后相关的AS事件的PI模型。随后通过KM生存分析和tROC的评估，证明通过PI进行风险分层能够使KIRC患者的生存结局得到区分。此外作者还进行了SF与AS事件之间相关调控网络的研究，为KIRC的遗传机制提供了启示。