随着伊莎贝拉一世和费尔南多征服战争的结束，西班牙也建立了天主教的宗教裁判所这个机构。天主教国王们寻求民族和宗教统一的政策，他们任命托马斯·德·托克马克为第一任宗教法庭的庭长。虽然，伊莎贝拉以经济为理由，反对对犹太人采取严厉苛刻的措施，托克马克使得费尔南多相信，需要驱逐犹太人。在1492年3月31日，两位国王发布了《阿尔罕布拉宫敕令》，就是驱逐犹太人的命令，规定在7月底为期限，在三个月内，他们必须离开这个国家，还不能携带自己的金、银、钱、马匹。传统上，一直认为，多达20万人的犹太人离开了西班牙。但是，近年来，历史学者认为这个数据有些夸大了。亨利·卡门表明出，总的8万犹太人口，最多只有4万人离开，其余的都转教了。
后来，伊莎贝拉接受了教皇亚历山大六世授予的“天主教国王”的头衔。随着西班牙王国的基本统一，伊莎贝拉和费尔南多也寻求精神上统一的过程，试着使得这个国家处在罗马天主教的信仰之下。除了日常的行政管理以外，两位国王还关心王位的继承，还致力于把西班牙王国和其它欧洲的统治者联系在一起。从1497年开始，他们的几个子女陆续与欧洲王室的成员联姻。阿斯图里亚斯亲王胡安与奥地利女大公玛格丽特结婚，建立了他们与哈布斯堡家族的联系，最后还导致了后者的家族统治西班牙。长女伊莎贝拉公主嫁给了葡萄牙国王曼努埃尔一世。他们的二女儿胡安娜嫁给了哈布斯堡的另外一名王子，他就是勃艮第的腓力。然而，伊莎贝拉为她两个最大孩子制定的计划没有实现。胡安王子出生于1478年，他从小体弱多病，身体一直就不好，但受过良好的教育。1495年1月20日，两位国王和哈布斯堡的皇帝马克西米连一世制定双重婚姻。1496年，公主胡安娜离开西班牙，与腓力结婚。腓力的妹妹玛格丽特时年18岁，在第二年的4月3日与王子胡安结婚。尽管，这门婚姻很短暂，但是他们深爱着对方。所有伊莎贝拉的孩子们都有着深情的天性，尽管是政治上的联姻。但是，宫廷医生们对王子胡安的健康充满着担心和忧愁。不幸的事情还是发生了。1497年10月4日，信使来到了国王夫妇的宫中，告诉了他们，王子病情非常严重。一个星期以前，王子和玛格丽特还参加了姐姐伊莎贝拉公主的婚礼。当费尔南多快速进入王子卧室的时候，胡安很快就去世了，他死于肺结核，时年19岁。
伊莎贝拉和费尔南多的画像
胡安王子过早的病逝，使得伊莎贝拉和费尔南多夫妇深感悲痛，他们令人为他雕刻了一个墓碑，上面书写着胡安的一些基本事迹，以及国王夫妇对儿子的情感。接下来，女王伊莎贝拉的长女伊莎贝拉死于难产，但她留下的儿子在两岁那年就夭折了。她原来希望伊莎贝拉公主能够像她当年那样，在未来的时候能够继承自己的王位，她已经被授予了阿斯图里亚斯公主的封号。然而，女王还是对她最后三个孩子选择了合适的婚姻。伊莎贝拉就把自己第三个女儿玛丽娅嫁给了自己的女婿，葡萄牙国王曼努埃尔一世。据说他们的婚姻很幸福，生育了十个孩子。玛丽娅出生于1482年6月29日，是夫妇俩人德第三个女儿，也是第四个孩子。据说，伊莎贝拉女王还怀过一对双胞胎女孩（也有人认为实际上就是双胞胎男孩），但是流产了。玛丽娅公主与她的姐姐和妹妹那样，都受过很好的文化教育，她会算术、拉丁文，几种外国语言、历史、哲学和古典文学。玛丽娅被当时人描述为性格比较严肃，但她是比较虔诚的，喜欢缝纫，时常教育和指导她的孩子们。在她怀孕期间，国王曼努埃尔总会送给她一些昂贵的衣服和珠宝。1517年，34岁的玛丽娅死于生孩子期间。后来，玛丽娅的长女伊莎贝拉嫁给了皇帝查理五世为妻子。
费尔南多二世的画像
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