随着伊莎贝拉一世和费尔南多征服战争的结束,西班牙也建立了天主教的宗教裁判所这个机构。天主教国王们寻求民族和宗教统一的政策,他们任命托马斯·德·托克马克为第一任宗教法庭的庭长。虽然,伊莎贝拉以经济为理由,反对对犹太人采取严厉苛刻的措施,托克马克使得费尔南多相信,需要驱逐犹太人。在1492年3月31日,两位国王发布了《阿尔罕布拉宫敕令》,就是驱逐犹太人的命令,规定在7月底为期限,在三个月内,他们必须离开这个国家,还不能携带自己的金、银、钱、马匹。传统上,一直认为,多达20万人的犹太人离开了西班牙。但是,近年来,历史学者认为这个数据有些夸大了。亨利·卡门表明出,总的8万犹太人口,最多只有4万人离开,其余的都转教了。
后来,伊莎贝拉接受了教皇亚历山大六世授予的“天主教国王”的头衔。随着西班牙王国的基本统一,伊莎贝拉和费尔南多也寻求精神上统一的过程,试着使得这个国家处在罗马天主教的信仰之下。除了日常的行政管理以外,两位国王还关心王位的继承,还致力于把西班牙王国和其它欧洲的统治者联系在一起。从1497年开始,他们的几个子女陆续与欧洲王室的成员联姻。阿斯图里亚斯亲王胡安与奥地利女大公玛格丽特结婚,建立了他们与哈布斯堡家族的联系,最后还导致了后者的家族统治西班牙。长女伊莎贝拉公主嫁给了葡萄牙国王曼努埃尔一世。他们的二女儿胡安娜嫁给了哈布斯堡的另外一名王子,他就是勃艮第的腓力。然而,伊莎贝拉为她两个最大孩子制定的计划没有实现。胡安王子出生于1478年,他从小体弱多病,身体一直就不好,但受过良好的教育。1495年1月20日,两位国王和哈布斯堡的皇帝马克西米连一世制定双重婚姻。1496年,公主胡安娜离开西班牙,与腓力结婚。腓力的妹妹玛格丽特时年18岁,在第二年的4月3日与王子胡安结婚。尽管,这门婚姻很短暂,但是他们深爱着对方。所有伊莎贝拉的孩子们都有着深情的天性,尽管是政治上的联姻。但是,宫廷医生们对王子胡安的健康充满着担心和忧愁。不幸的事情还是发生了。1497年10月4日,信使来到了国王夫妇的宫中,告诉了他们,王子病情非常严重。一个星期以前,王子和玛格丽特还参加了姐姐伊莎贝拉公主的婚礼。当费尔南多快速进入王子卧室的时候,胡安很快就去世了,他死于肺结核,时年19岁。
伊莎贝拉和费尔南多的画像
胡安王子过早的病逝,使得伊莎贝拉和费尔南多夫妇深感悲痛,他们令人为他雕刻了一个墓碑,上面书写着胡安的一些基本事迹,以及国王夫妇对儿子的情感。接下来,女王伊莎贝拉的长女伊莎贝拉死于难产,但她留下的儿子在两岁那年就夭折了。她原来希望伊莎贝拉公主能够像她当年那样,在未来的时候能够继承自己的王位,她已经被授予了阿斯图里亚斯公主的封号。然而,女王还是对她最后三个孩子选择了合适的婚姻。伊莎贝拉就把自己第三个女儿玛丽娅嫁给了自己的女婿,葡萄牙国王曼努埃尔一世。据说他们的婚姻很幸福,生育了十个孩子。玛丽娅出生于1482年6月29日,是夫妇俩人德第三个女儿,也是第四个孩子。据说,伊莎贝拉女王还怀过一对双胞胎女孩(也有人认为实际上就是双胞胎男孩),但是流产了。玛丽娅公主与她的姐姐和妹妹那样,都受过很好的文化教育,她会算术、拉丁文,几种外国语言、历史、哲学和古典文学。玛丽娅被当时人描述为性格比较严肃,但她是比较虔诚的,喜欢缝纫,时常教育和指导她的孩子们。在她怀孕期间,国王曼努埃尔总会送给她一些昂贵的衣服和珠宝。1517年,34岁的玛丽娅死于生孩子期间。后来,玛丽娅的长女伊莎贝拉嫁给了皇帝查理五世为妻子。
费尔南多二世的画像
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