HEPES 产品是生物化工中重要的生化制剂, 也在生物学研究中被认为是最好的万能缓冲剂之一,广泛应用于临床检验诊断试剂、生命科学研究、制药和生物技术等诸多领域。这里主要介绍HEPES的生产制备方法和HEPES缓冲液的配制方法以及使用。
制备方法一:
直接使用1,2-二氯乙烷作为溶剂，在装有机械搅拌、温度计的100mL的三口瓶中加入羟乙基哌嗪（5.00g,0.02mol)，碳酸钾K2CO3（6.00g，0.04mol），50mL1,2-二氯乙烷，油浴加热90℃（1,2-二氯乙烷沸点85℃），搅拌反应20h。停反应，过滤，用200mL乙酸乙酯（EA）洗涤滤出的盐。滤液旋干，得2.6gHEPES固体。
制备方法二：
在装有磁力搅拌器、回流冷凝管的三口瓶中依次加入11.0g(84.5mmol)无水亚硫酸钠、27.0mL（343.6mmol)二氯乙烷、120mL水、110mL乙醇，50mg铜粉，搅拌，油浴加热升温到回流。回流22h后，将反应液减压蒸除水，至白色固体全部析出。此固体主要由产物、未反应的原料和生成的盐组成。将所得固体及500mL乙醇加入1L烧瓶中，加热回流40min。趁热抽滤，滤液冷却后，0℃放置过夜。抽滤，真空干燥，得片状结晶，产量11.40g，收率81.0％。
在装有磁力搅拌器、回流冷凝管、温度计的四口瓶中依次加入氯乙磺酸钠（15.10g，0.08mol），羟乙基哌嗪（9.88g，0.075mol），60mL水，油浴105℃搅拌反应，随着反应进行，反应液的pH会下降，滴加5mol/LNaOH水溶液，控制pH在9左右，共计加入15mL，再继续反应5h。
反应结束，将反应液加水稀释到500mL，上离子交换树脂柱（约500g）进行去盐纯化，反应液全部上柱之后，用蒸馏水冲至流出液pH为6，再用1mol/L氨水淋洗，收集TLC检测有产物点的流出液（pH约5~9）。旋蒸浓缩至150mL，加入活性炭脱色，油浴110℃，加热搅拌0.5h，过滤，旋干滤液，加入50mL乙醇，加热回流0.5h，热过滤，所得白色固体干燥后为8.63g。滤液滴加冰醋酸，调pH到5，0℃冷却过夜，过滤，所得固体干燥后为2.80g。与前述HEPES固体共计11.43g，收率64.5%。
缓冲液配制：
1、10mmol/L HEPES缓冲液配制方法如下:准确称取HEPES 2.383g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。如果用于加入细胞培养液中作缓冲剂，建议培养液避光保存，因为有研究报道培养液中的HEPES在可见光下暴露3h以上将产生对细胞有毒性的过氧化氢。
2、500ml 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock solution的配制
119.15 g HEPES 溶解在400ml蒸馏水中，加0.5~1M 的NaOH水溶液调节至所需pH(HEPES的有效pH 范围是6.8~8.2)，然后用蒸馏水定容至500ml，于4摄氏度保存。
3、加少量盐的HEPES Buffer配方(500ml)
HEPES 6.5g、NaCl 8.0g、Na2HPO4.7H2O 0.198g、用0.5M NaOH 水溶液调节pH值，最后定容。
4、2×HEPES缓冲盐溶液的配制：将1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucan or dextran)和1g HEPES溶解在90ml的蒸馏水，用0.5M NaOH调节至所需pH值，再用蒸馏水定容至100ml即可。
使用方法：
1、HEPES可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中，再过滤除菌。每1000ml培养液中加入2.38克HEPES，待溶后用lN NaOH 调pH至7.2，滤过除菌后使用。此时HEPES的使用浓度为10 mmol/L。
2、亦可配成 100 x 贮存液(l mol/L)，使用前取 99ml培养液加入 lml贮存液，最终应用浓度仍为10mmol/L。l mol/L(100 x)HEPES贮存液配制方法：取23.8g HEPES溶于90ml双蒸水中，用lN NaOH调pH至7.5一8.0，然后用水定容至100ml，过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，4℃或-20℃保存。
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