XX胚胎干细胞基因组整体低甲基化

Global hypomethylation of the genome in XX embryonic stem cells

|核心内容：

胚胎干细胞是研究基因功能的重要工具，也可能在细胞治疗应用中发挥重要作用。

从小鼠囊胚中建立稳定的XX ES细胞系是相对困难的，因为两条X染色体中的一条经常丢失。

在这里，我们显示在XX ES细胞系中DNA甲基化在全基因组范围内减少，这归因于两条活跃的X染色体的存在。

图1. XX ES 细胞主要卫星序列的低甲基化

利用小鼠主要卫星重复序列特异性探针进行Southern blots (DNA blots)实验。这些重复序列使用不敏感的甲基化酶 MspI (M)作为条带阶梯出现。甲基化敏感异位体 HpaII (H)只消化未甲基化的位点。所有细胞系的M都有被消化成不同大小的DNA片段，但是H这一项只有XX ES的细胞系被消化下来，说明只有XX ES是低甲基化状态。(a) XX ES 细胞系 PGK12.1(PGK)及和LF2。(b) XY ES 细胞系，Efc-1和129/1。(c) PGK12.1细胞(Undiff)和体外分化细胞(Diff)。(d)女性儿童(XX)肾脏的 DNA。(e) X0 ES 细胞系，B3和 A11。

图2. XX ES 细胞的全基因组低甲基化

(a)用 MspI (m)或 HpaII (h)消化 c 型逆转录病毒序列(pMo 探针)后 Southern-blot 分析，发现 PGK12.1 XX ES 细胞(PGK)与129/1 XY ES 细胞相比有低甲基化现象。箭头指出了与甲基化(m)序列和非甲基化(u)序列相对应的带。

(b，c)位于 Mtm1位点上游30kb 的667bp 基因内区域的亚硫酸氢盐甲基化序列分析，包括129/1(XY)中的4个'甲基化’ CpG 二核苷酸(1-4)和 PGK12.1(PGK) XX ES 细胞中的一个380bp 区域，以及包含5个'甲基化’ CpG 位点的 Hprt 位点内含子4中的一个380bp 区域(1-5)。甲基化(填充圈,黑色实心)和非甲基化(开放圈，白色空心) CpG 二核苷酸显示为一些独立的测序模板(水平线)。

(d)小鼠 Xist 基因启动子 i 区 SacII 和 MluI 限制性内切酶位点在 XX 和 XY ES 细胞 DNA 中的定量 southern 印迹分析。用 EcoRI 和 SacII (左面板)或 MluI (右面板)进行 DNA 切割。控件(c)显示单独使用 EcoRI 的样品切割。每个样本中的甲基化百分比(在每个面板下面显示)通过分析磷酸化图像筛选暴露量进行量化。

（e）最近邻分析量化全基因组甲基化水平。所选区域显示二氯丙醇和甲基化二氯丙醇(mdCp)的信号。DNA 来自 XY 和 XX 小鼠肾脏(体细胞)或 ES 细胞系。图表显示了根据磷图像分析，甲基化的 dCp 在 dCp 总量中所占的百分比。

低甲基化影响重复序列和一些独特的序列，后者包括调控父母印记基因表达的差异甲基化区域（ICR）。印记基因对正常发育有重要作用。

在早期传代孤雌生殖ES细胞中，随着X染色体的消除，差异甲基化区域的甲基化可以恢复，这表明针对甲基化缺失的选择可能为X染色体的不稳定性提供了基础。

最后，我们发现低甲基化与从头DNA甲基转移酶DNMT3a和Dnmt3b水平降低有关，并且这些因子的异位表达恢复了整体甲基化水平。

原文摘要：

Embryonic stem (ES) cells are important tools in the study of gene function and may also become important in cell therapy applications1. Establishment of stable XX ES cell lines from mouse blastocysts is relatively problematic owing to frequent loss of one of the two X chromosomes. Here we show that DNA methylation is globally reduced in XX ES cell lines and that this is attributable to the presence of two active X chromosomes. Hypomethylation affects both repetitive and unique sequences, the latter including differentially methylated regions that regulate expression of parentally imprinted genes. Methylation of differentially methylated regions can be restored coincident with elimination of an X chromosome in early-passage parthenogenetic ES cells, suggesting that selection against loss of methylation may provide the basis for X-chromosome instability. Finally, we show that hypomethylation is associated with reduced levels of the de novo DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b and that ectopic expression of these factors restores global methylation levels.

参考文献：

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