在本研究中，华大生命科学研究院、广东省人民医院费继锋教授团队与武汉大学陈亮教授团队等多家科研机构利用华大研发的时空转录组技术（Stereo-seq）对墨西哥钝口螈不同发育阶段的端脑样本和端脑损伤处理后不同天数的再生阶段样本进行大量测序，鉴定了蝾螈端脑再生过程中特有的重要神经干细胞亚型（reactive ependymoglial cell, reaEGC），并比较了其状态与发育时期神经干细胞的相似性，对理解哺乳动物大脑再生研究具有重要的指导意义。
Science(IF=63.71)（2022年3月8日提交；2022年7月6日接收；2022年9月2日在线发表)|文章标题：
Single-cell Stereo-seq reveals induced progenitor cells involved in axolotl brain regeneration
（单细胞空间全转录组测序揭示参与蝾螈脑再生的诱导祖细胞）
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https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/science.abp9444今年7月23日，饶毅教授在朋友圈转发华大集团CEO尹烨发在“尹哥聊基因”“生命认知学”视频号的多条短视频，直言尹烨在相关视频中所表述的观点为“伪科学”且“愚蠢无比”。此后几天，饶毅教授连续在其微信公众号“饶议科学” 发多篇文章炮轰华大集团CEO尹烨“水博士、忽悠、哗众取宠、伪科学、卖假药”。
2022年8月27日，饶毅教授又在”饶议科学“上以《核心技术追问：中国的人类基因研究为什么弱？》为题重发这篇他于2018年9月17日发在“知识分子 ”公众号的文章。文章里面提到：
“明星企业'华大基因’长于购买国外仪器、用国外方法，为市场提供民工式的科技服务；它本身的技术能力含量低于能够制造精密仪器的富士康的能力。在诸多方面，如发现新基因、找基因的新功能、阐明基因与疾病或健康的关系，或发明有效预防、诊断或治疗疾病的方法，等等，华大基因也许远低于其宣传所造成的印象。”
“我国科研的投资和产业发展，需要避开先被无良企业忽悠、后发现掉进坑里转而加入忽悠大合唱、以便自己解脱的互害模式。下力气寻找和发现对中国真正有应用意义的成果和科技人员，将中国在人类基因研究方面最有应用意义的发现推向产业，既造福人类，也能得到长期良性回报。”（原文没有说华大基因是无良企业，但是很难不让读者在两者之间画个连接号，同时思考华大基因是否是一个无良企业。）
“大量投入经费购买国外的测序仪器，还冒着仪器更新换代的风险，特别是全新的经济适用的仪器替代昂贵仪器的的风险。创造性提出新方法、自主开发新型的高质量仪器，才能降低一贯依赖的问题、才能减小风险。”（前文提到“华大基因”长于购买国外仪器，这里可以理解为华大基因正在面临这些风险的考验。）
现在看来，饶毅教授针对华大基因当时的情况罗列并分析了一些事实，同时也给出了自己深刻且独特的见解、建议和期盼。这种批判的声音是很难得的，虽然有点针对华大，但是好公司就需要经得起批判和推敲。华为也是在各种打击下坚持聚拢优秀人才，坚定发展核心技术的策略，势要突破西方的技术壁垒，这才有其自主研发的5G、麒麟、鸿蒙、自动驾驶技术等等。
不知华大基因的高层2018年时是否读到饶毅教授的这篇文章，但是从最近几年华大发表的文章来看，华大已经在自主研发技术上有了重大突破，反向推理很容易想到华大肯定早已意识到核心技术的重要性并且暗中布局了。
2018年-2021年期间华大作为第一作者或通讯作者在CNS期刊上发表了多篇文章，具体如下：
2020年，“空间全转录组测序技术”被Nature Methods评为年度技术方法。2021年1月，华大Stereomics®技术研究内容在BioRxiv上进行了预印刊载。Chen, A. et al. .bioRxiv 2021.01.17.427004 (2021)
2022年5月5日，时空组学联盟（STOC）在深圳宣布成立，首期成果为实现了全球首批生命全景图谱绘制。（所谓时空转录组，就是整合了不同时间段的空间转录组数据。）
华大自主研发的Stereomics®是一项实现超高通量、超高精度的全景式时空转录组技术，通过时空芯片（Stereo Chip）捕获组织中的mRNA，并通过空间条形码（Coordinate ID, CID）还原回空间位置，实现组织空间检测，为深入地了解细胞的基因表达及形态与局部环境之间的关系建立基础。
该技术的诞生，突破了分辨率和检测组织大小的限制，相比国际上同类技术，华大的时空组学技术是全世界唯一一项能同时实现“亚细胞级分辨率”和“厘米级全景视场”的原位捕获空间全转录组测序技术，并可以实现基因与影像同时分析，在RNA测序以及空间分辨的表观基因组学（如染色质可及性分析和DNA甲基化检测）和基因组测序等方面具有潜在的应用前景和价值；相较于传统的生物信息学的组学研究显然更具有应用于相关研究的前景和价值。
该技术首次实现生命全景时空分子图谱，在生物化学与分子生物学相关的研究方向有着十分可观的应用前景——在未来或许是必需的，甚至有望带来生命科学领域第三次科技革命。（DNA双螺旋结构的发现被誉为生命科学史上的“第一场革命”，2003年完成人类基因组计划则被科学界广泛接受为生命科学的“第二场革命”。
2022年以来，凭借其自主研发的测序和分析技术，华大已经实现了CNS（Cell、Nature和Science）大满贯！其时空组学与单细胞组学相关成果如下：
3月22日 ，合作在体外成功诱导人类8细胞期全能干细胞，完成再生医学领域的颠覆性突破。https://www.nature.com/articles/s41586-022-04625-0
4月13日，绘制全球首个非人灵长类动物食蟹猴全细胞图谱，为人类疾病研究提供底层工具。https://www.nature.com/articles/s41586-022-04587-3
5月4日，描绘全球首个小鼠胚胎生命时空全景图谱，实现生命科学工具的里程碑式突破(封面故事）。https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00399-3 9月2日，建立全球首个蝾螈单细胞分辨率脑再生时空图谱，揭示大脑修复的分子和细胞机制(封面故事) 。https://www.science.org/doi/10.1126/science.abp9444简单来说，这篇最新的science文章的研究就是从钝口螈身上取下一些端脑组织样品进行测序、然后对测序结果进行生物信息学分析。这些样品包括不同发育时期的端脑组织，它们的转录组含有发育的秘密，而损伤后不同时期的端脑组织转录组含有组织再生的秘密。接下来我们详细介绍一下。
Q1. 研究背景是什么？为何要选钝口螈作为研究对象？
再生模式动物：墨西哥钝口螈（axolotl），和其他蝾螈一样，是一种两栖脊椎动物，再生能力极强。
相信很多人都认同生命科学最终目标是为人类健康保驾护航。人类大脑在遭受由创伤、中风及神经退行性疾病等所引发的神经元损伤后，由于其自我修复能力低下，且缺乏有效的临床治疗手段，大多最终导致大脑功能（部分）丧失。
这将严重影响人类的重要生命活动，包括行为、情感、记忆等等。如何在大脑受损后促进其再生修复，从而恢复正常的功能是急需解决的生物学及医学难题。
解决这一难题的限制因素之一就是我们对脑再生机制缺乏足够的理解。但是我们又不能直接在人身上进行大脑的损伤修复机制研究，所以不得不找一个替代的研究模型，也就是科研人员常说的模式动物。
“模式动物指的是生物学家通过对选定的动物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式动物。在生命科学、人类医药和健康研究领域，实验动物在生命活动中的生理和病理过程，与人类或异种动物都有很多相似之处，并可互为参照，一种动物的生命活动过程可以成为人类或者另一种动物的参照物。对一些难以在人身上进行的工作，及一些数量很少的珍稀动物，或一些因体型庞大、不易实施操作的动物种类，采用取材容易、操作简便的另一种动物来代替人类或原来的目标动物进行实验研究，这就是动物实验。为了保证这些动物实验更科学、准确和重复性好，可以用各种方法把一些需要研究的生理或病理活动相对稳定地显现标准化的实验动物身上，供实验研究之用。这些标准化的实验动物就称之为模式动物”——刘民编,医学实验动物学,安徽大学出版社,2012.05,第121页
人是脊椎动物，在脊椎动物中，蝾螈表现出了强大的器官再生能力，并且蝾螈的端脑在进化上较贴近高等哺乳动物，具有与高等动物较为相似的细胞学构成及解剖学结构，所以它是研究大脑再生的最佳模型。
Q2. 如何取样？以及后续实验流程和方法？
研究人员收集了各个具有代表性的发育阶段的端脑样本，包括：stage44（破膜后第一次进食）、stage54（前肢生长完成）、stage57（后肢生长完成）、青少年阶段（juvenile）、成年阶段（adult）、变态阶段（metamorphosis）；以及蝾螈端脑损伤处理后不同天数（days post-injury，DPI）的再生阶段样本：对照组（同juvenile 1张）、2 DPI（3张）、5 DPI（3张）、10 DPI（3张）、15 DPI（4张）、20 DPI（3张）、30 DPI（1张）、60 DPI（1张）。然后采用华大自主研发的Stereo-seq技术流程对所有采集到的脑切片进行组织固定、细胞核染色拍照、组织透化及原位反转录、空间条码标记和测序文库构建及测序。获取了能够覆盖整个端脑切片的空间转录组数据。依靠Stereo-seq技术所具有的单细胞分辨率优势，实现了对蝾螈大脑发育、再生过程中单细胞转录组的原位捕获及分析。通过对所获数据的大规模整合分析，获得了一系列端脑发育与再生的空间转录组图谱。
样品采集分析示意图
Q3. 实验结果如何？蝾螈脑损伤再生阶段是一个过程，但重要的是结果。成年之后的蝾螈身体长度在10-15厘米之间，肉眼也可以看到修复的情况，但为了定义一个分子水平的损伤修复评估标准，科研人员先采取成年蝾螈端脑组织，然后用Stereo-seq技术对其进行深度测序，描绘蝾螈端脑的转录图谱。同时利用细胞分割完成单细胞水平的空间转录图谱的构建（Fig1AB）。其端脑细胞被划分为脑室区（VZ）等六个区域，分别与蝾螈端脑的解剖区域相对应（Fig1C）。研究人员描绘了所有细胞类型的基因转录图谱，并确定了16种细胞类型，包括三个位于VZ区的EGC类群（Fig1DEFG）。有意思的是，GO分析结果表明成年蝾螈端脑组织中高表达核糖体相关基因的ribEGC可能具有活跃的增殖特性（Fig1H）。
因为新生组织是由细胞构成的，而新细胞只能由已存在的细胞分裂而来（课本：细胞学说内容之一），所以组织的损伤修复需要大量的细胞增殖活动。高表达核糖体相关基因的ribEGC可能具有活跃的增殖特性也就意味着ribEGC很可能是本研究的一个关键点。
Fig1.成年蝾螈端脑时空图谱
发育是一个基因选择性表达的过程，也是细胞发育潜能逐渐递减的过程，具体来说是：全能干细胞依次转变成多能干细胞、单能干细胞，最后变成功能特异的体细胞。研究人员在测序结果中发现了各个发育阶段的33种细胞类型，描绘了它们在不同发育时期端脑的动态分布特点（Fig2.A），其中室管膜胶质细胞（EGC）是干细胞，根据基因表达特征的差异又可以将它们分为四个亚型，即dEGC, wntEGC, sfrpEGC和ribEGC。它们都可以进一步分化发育。表达早期发育基因的dEGC出现在stage44，并随着发育逐渐减少，而后在青少年阶段消失并特化成三种EGC的亚型（Fig2.B）。
通过比较所有细胞在神经干性、细胞周期和蛋白质翻译活性这三个方面的差异，他们发现发育早期VZ区EGC增殖和分化潜能强，而在发育后期这些模块的高表达细胞减少，并限制在VZ的腹侧（Fig2.C）
Fig2.蝾螈端脑发育时空图谱
对测序数据可视化后可以发现，蝾螈脑损伤在再生阶段新增了8种细胞类型，并在30天内即愈合，而在60天时所有细胞类型已经恢复（Fig3.BCD）。
具体来说，在损伤早期（2~5 天），伤口附近出现了新的神经元细胞，这些新的未成熟的神经元和对侧相同脑区位置的nptxEX细胞在表达特征上是不一样的。因为对侧相同脑区没有损伤，所以这些区域的细胞就是原来的、老的细胞，可以用来作为对照组。科研人员把伤口附近出现的新的神经元细胞命名为损伤刺激性神经元（wound stimulated neuron，WSN）（Fig3.E、F）。
在损伤后2~15 天，伤口附近出现了一类高表达C1qb和Ctsl基因的小胶质细胞，它们可能与损伤后的免疫反应有关；同期，伤口附近还出现了一类高表达Vim等神经干细胞标志基因的激活态EGC（reaEGC）细胞，它们可能对再生过程有促进作用。
此外，研究人员还发现组织修复与再生中关键蛋白Tnc以及Sdc1在伤口周围有强烈表达，并且在reaEGC和WSN中有较高的相互作用（Fig3.G、H）。
Fig3.蝾螈端脑再生的时空图谱(A为样本采集示意图)
reaEGC能否修复丢失神经元？
为了回答这个问题，研究人员在再生阶段15 DPI时，沿着首尾轴从伤口中心向尾侧做了4个连续切片，收集了蝾螈脑损伤在再生阶段15 DPI时时的所有细胞类型，然后并进行Stereo-seq分析，看看是否能够找到reaEGCs和不成熟神经元（immature neuron，IMN）之间相互转换的证据。
测序分析结果表明，reaEGCs和不成熟神经元之间存在一种再生特异性细胞群，它们同时表达reaEGCs和IMN的标记基因（Fig4.A、B），科研人员把这种处于中间态的再生特异性细胞群命名为rIPC1。
这暗示reaEGC可能先转换为rIPC1，然后rIPC1转换为IMN，IMN接着转换为nptxEX从而实现伤口损伤的再生修复。
为了验证这个猜想，研究人员进一步将15DPI分成三个区域，并进行RNA速度和Monocle拟时序分析，发现reaEGC-rIPC1-IMN-npxEX轴很可能是真的（Fig4.C~E）。以此为基础，研究人员分析了沿着拟时序轴的基因表达的变化，观察到与潜在转换相匹配的基因表达变化和基因功能（Fig4.F、G）。紧接着，研究人员对2 DPI到60 DPI的再生相关细胞进行Monocle3拟时序轨迹分析，结果也支持reaEGC-rIPC1-IMN-nptxEX的模式（Fig4.H）。最后，研究人员进一步在空间数据中展示了拟时序轨迹结果（Fig4.I）。
结果表明，蝾螈端脑再生过程中存在着一种沿着reaEGC-rIPC1-IMN-npxEX轴的细胞谱系转换过程。在这个过程中，reaEGCs的持续增殖覆盖了伤口，同时转换或分化为中间态和成熟神经元来重建损伤的脑组织。这与大脑的发育过程相似。
Fig4.蝾螈端脑再生过程中的细胞谱系转变
既然蝾螈端脑损伤再生过程与大脑的发育过程相似，那么再生过程与发育过程有何异同？
首先，研究人员发现发育阶段Stage57和再生阶段15 DPI-4的空间结构具有高度相似性（Fig5.A、B），表明再生过程与发育过程没有明显差别。
有趣的是，发育阶段的Stage44、Stage54、Stage57、青少年阶段和再生阶段的15 DPI-4中所有神经干细胞EGCs的相关性分析结果显示，再生阶段的细胞类型中存在一种再生特异的室管膜胶质细胞亚型reaEGC。reaEGCs的基因表达特征与Stage57的dEGC基因表达谱最为相似，例如，Nes和Nptx1等标记在15DPI-4和第57阶段之间的空间分布相似，但是与发育过程中所鉴定的其他EGC细胞类型均存在较大差异（Fig5.CDE）。
由于dEGCs出现在发育的早期阶段，并可能随后转化或分化为其他EGC类型和神经元，而成年期组织缺乏dEGCs，再根据其所处位置及基因表达特点，研究人员认为损伤再生信号诱导了神经元的命运重编程，让成熟的神经元细胞重获发育潜能。
RNA速度分析和Monocle分析结果表明，发育和再生过程中成熟神经元的形成具有相似的谱系转变轨迹：即先从祖细胞EGCs分化成IPCs，再分化为未成熟的神经元和成熟神经元（Fig5.F、H）。
最后，研究人员通过对比发育和再生的分子表达特征，描绘了再生与发育中相似及差异的相关通路特征（Fig5.5I、J）。
总之，蝾螈端脑损伤再生过程与大脑的发育过程非常相似，但是再生过程也有独特的特征。
Fig5.蝾螈端脑发育与再生过程中神经元形成的比较
Q4. 本研究的意义
如果说全基因组测序序列结果是"冰冷的"，"生死未卜的"（很多序列没有转录活性），那么，时空转录组测序结果就是鲜活的，因为转录组就是基因组序列的活化形式。从这个角度思考，转录组图谱的信息更有价值。
该研究全球首次在单细胞水平上获取蝾螈端脑正常发育和端脑损伤组织再生修复过程中多个时间点的空间转录组数据，构建所谓的时空转录组图谱。通过脑损伤的拟时序分析，发现神经元再生过程中的细胞谱系空间动态变化规律。在描绘完两个过程的时空转录组图谱后，他们发现这两个过程非常相似，损伤修复的过程像是发育过程的重启。此外，他们还发现两个过程的不同之处。
正常发育过程中，与发育相关的EGC亚型dEGC在Stage44出现，而在青少年阶段之后消失。损伤修复过程早期出现且与再生密切相关的神经干细胞亚型reaEGC，这是再生修复过程中特有的干细胞亚型。
该研究呈现了一个完整的详细的组织损伤修复模式，同时产生了大量的公用数据供给全世界的相关科研人员参考。
蝾螈是脊椎动物进化的关键节点，其脑单细胞时空转录组数据还可用来进一步研究脊椎动物脑的发育，再生和进化机制等等。它也为提高哺乳动物大脑再生能力的相关研究提供了一个可参考的研究思路。
最近几年重编程技术用于损伤组织修复的研究 有很多（下面一篇文章单独列出了），如果相关的研究借鉴本研究的方法，或者整合本研究的数据来分析，有可能获得更多不为人知的秘密。
在本研究之后，若是可以在哺乳动物模型（比如小鼠、树鼩、猴）身上复现相关机制，那么我们离最终的目标就更近一步了。
幻想一下。或许将来有一天，我们可以通过基因编辑疗法、细胞疗法、在体重编程等方法提高人类组织器官的自我修复能力。甚至有可能将低等脊椎动物的超强再生系统改造优化过后导入到人类基因组中。
Q5. 讨论&本研究的不足之处？
从科学研究设计本身来看，该研究是完美的。
如果一定要说不足之处，我觉得它美中不足的点在于它没有分析损伤诱导的重编程是否会引起基因组的突变。因为在重编程过程中基因组的可及性和表观遗传标记会发生广泛的重塑，这些都可能影响基因组的稳定性。这个再生模型看起来太完美了，但是这并不能让她们称为生物进化的优势物种，所以我猜测它们肯定在这个损伤再生过程中付出了一些”无法挽回的的代价“，比如基因组的插入、缺失、或稳定性降低等等。
此外，它确实没有发现新的疾病类型，没有指导现有疾病的治疗，不能改善人们的生活质量和身体健康状况。但是能否直接跟疾病相关或直接用来治疗疾病并不是科学研究好坏的唯一标准，很多基础研究离临床研究十分遥远，甚至只是为了解释某种自然现象或规律，但这并不影响他们本身的意义。就连1953年DNA双螺旋的发现也没有直接跟疾病挂钩，或者说不能直接治疗某种疾病，但没有人怀疑它的价值。
既然人类大脑的研究势在必行，而蝾螈是我们能找到的可研究的最好模型，那它就是最佳的选择，这相比于最终的目标来说可能是一大步，也可能只是一小步，但若不积跬步，何以至千里？一定要在人细胞或人体重现且有利于疾病的治疗的研究才算好研究的这种思维是否也是一种"急于求成"或者”广义上的自私“？蝾螈的基因组是人基因组的十倍，相对应的分子或者细胞机制肯定不能直接照搬到人身上，但是揭秘其超强再生能力的机制本身就是一种美，也是对人类认知边界的拓展，这就是人类文明的进步。
#小尾巴~（本研究提供的数据）
Stereo-seq数据集获取网址：
https://db.cngb.org/stomics/artista/
本研究原始数据通过CNSA数据库获得，数据编号为：
CNP0002068
分析代码获取网址：
https://github.com/BGI-DEV-REG/ARTISTA
参考文献：(其他已经放在文中方便直接搜索查询）
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abp9444
最后，放一张会让人黯然神伤的图，同时希望相关科研人员好好设计实验，让这些小可爱少上断头台，因为做成实验标本后就不能再生了...
