ctDNA仅占cfDNA的0.1%~5%，且不同癌种、不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大。因此，需要超敏感方法来检测ctDNA携带的特征信息（包括突变、重排、拷贝数异常、甲基化等）。中篇将介绍ctDNA的各种分析方法。
5.ctDNA的分析方法
循环cfDNA主要由源自正常细胞的种系DNA组成，存在于癌症患者中的ctDNA相对较少且高度可变。因此，传统DNA分析方法(如Sanger测序，焦磷酸测序)的灵敏度不足以检测癌症患者血浆ctDNA中的体细胞突变。
目前ctDNA的分析方法主要有三种：以ARMS为代表的定量PCR技术；以ddPCR为代表的数字PCR技术；基于下一代测序(NGS)的高通量检测技术。近年来也出现了核酸质谱技术和EFIRM技术。
5.1ARMS技术
ARMS全称amplification refractory mutation system(扩增受阻突变体系)，又称等位基因特异性扩增法，是一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA中各种点突变的新方法。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计引物，使3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。ARMS技术结合电泳或荧光定量PCR方法进行检测，前者利用凝胶电泳技术检测扩增带，从而实现结果分析，后者指ARMS技术结合探针对扩增产物进行检测，在荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。目前采用电泳分析仍是主流，结合定量PCR的还较少。
四引物ARMS-PCR方法的示意图（该方法基于具有两组引物的PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。一组内部引物对于对突变和野生型等位基因是特异性的，并且它们彼此相对设计，另一组外部引物用于在PCR反应中产生对照条带。两个外部引物和内部—外部引物可以相互反应并产生不同长度的产物，它们可以在凝胶电泳中分离。）
资料来源：Iran J Public Health 44(3):380-7, 2015，宽华投研团队整理
ARMS技术具有成本低、简便快速、特异性好、技术普及度高等特点，非常适合医院广泛开展。ARMS技术已成为目前欧盟及中国CFDA批准用于临床的血液检测方法，同时获得专家共识的推荐。然而ARMS技术检测灵敏度有限（检测限度为1%），单次只能检测单个基因且只能用于检测已知突变，在一定程度上限制其应用。
艾德生物基于ARMS技术开发了升级版Super-ARMS，其保留了ARMS技术简便快速，特异性好，技术普及度高等特点，非常适合医院广泛开展，同时进一步提高检测灵敏度（0.01-0.2%），满足血液ctDNA检测的要求，更适合作为血液ctDNA检测的临床普及技术。
5.2数字PCR技术
qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。每扩增一条DNA链，就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放，实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步，可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算，获得待测样品模板的初始浓度。但是，qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量，无法做到精准绝对定量。
qPCR示意图（使用基因特异性引物，通过掺入双链DNA特异性染料或通过聚合酶5'-3'外切核酸酶活性释放TaqMan FRET（荧光共振能量转移）探针检测靶标的初始浓度。）
资料来源：Nat Rev Genet. 2016 May 17;17(6):333-51，宽华投研团队整理
20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digital PCR，dPCR)的概念，与qPCR不同的是，数字PCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。数字PCR一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。数字PCR通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
根据反应单元类型不同，数字PCR分为三类：微反应室/孔板、微流控芯片和微滴数字PCR系统。目前通过数字PCR方法进行ctDNA分析的主要技术有ddPCR和BEAMing。
5.2.1ddPCR
ddPCR全称droplet digital PCR(微滴数字PCR)。该技术属于Bio-Rad公司，可实现绝对定量和稀有等位基因的检测，其工作原理为：首先将血浆中分离出的DNA分割成一个个的小微滴，置于不同的微孔中，便于形成多个独立、平行的反应；随后对微孔中的DNA同时进行PCR扩增。在扩增时通过特定的化学试剂和染料探针标记其中的阳性分子，即ctDNA，检测到ctDNA会有信号累积；最后对每个孔的信号累积情况进行计算和定量分析，即可计算出原始样品中ctDNA的含量。该技术灵敏度高达0.001%，能够检测到血液中痕量的ctDNA，可有效适用于肿瘤的早期筛查，但是不能检测未知突变，且不能高通量。
ddPCR检测ctDNA示意图
资料来源：银河证券，宽华投研团队整理
5.2.2BEAMing
该方法基于小珠(Bead)、乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic)这四个主要组分来构建，所以被称作为BEAMing。BEAMing结合了数字PCR以及流式技术，通过磁珠克隆DNA。利用特异性PCR引物扩增目标突变区后，与磁珠（磁珠上固定有特异的PCR引物）混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后，利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物，发出红色或绿色荧光。使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。BEAMing技术具有较高的灵敏度（0.01%），但是这项技术只能检测已知突变，且成本较高。同时，它的操作也较复杂，通量低。
BEAMing技术（步骤1：链霉亲和素包被的磁珠与生物素标记的寡核苷酸结合。步骤2： 含水混合物（包含PCR所需的所有成分、结合引物的磁珠和模板DNA）与油/洗涤剂混合物一起搅拌以产生微乳液；含水隔室（灰色油层中的白色圆圈）含有平均少于一个模板分子和少于一个珠子；红色和绿色模板代表两个模板分子，其序列相差一个或多个核苷酸。步骤3：如常规PCR中那样对微乳液进行温度循环；如果DNA模板和磁珠一起存在于单个水性隔室中，则磁珠结合的寡核苷酸作为扩增的引物；连接到磁珠的红色和绿色直线代表来自两种不同模板的延伸产品。步骤4：破坏乳液，用磁铁纯化磁珠。步骤5：变性后，将磁珠与能区分不同种类模板序列的寡核苷酸（杂交探针）一起温育；然后使用荧光标记的抗体标记结合的杂交探针，这使得在适当的激光激发后含有PCR产物的磁珠为红色或绿色。步骤6：流式细胞术用于计数红色和绿色磁珠。）
资料来源：PNAS July 22, 2003 100 (15)，宽华投研团队整理
5.3NGS技术
数字PCR技术，具有极高的敏感性，可绝对定量；但该方法操作复杂，一次仅能检测少数突变位点，且不能检测融合变异。为了提高检测通量和效率，以NGS为核心的测序技术被广泛应用于ctDNA的下游分析，范围从全基因组或全外显子组测序到有限基因组的靶向测序。NGS可实现对多基因核酸片段进行高通量平行深度测序，能够同步检测多个基因、不同形式（如突变、拷贝数改变和基因融合）及未知突变，在预后和疗效判断的时候，多基因的参与可能对预后效果产生非常大的影响。
5.3.1NGS技术的原理
NGS是最近十多年诞生的DNA测序技术，它能同时对几十万到几百万个DNA分子进行平行测定，与传统的一代测序技术相比，具有高通量、高敏感性等优势，因此也称为高通量测序技术，是对传统Sanger测序革命性的改变。
NGS的测序步骤主要有（1）文库构建，构建文库时需要将DNA随机片段化并在两头加上特定的接头（adaptor）；（2）文库分子大规模平行克隆扩增，使用桥式扩增或者乳液PCR方法，对文库中的DNA片段进行克隆扩增，以产生足够拷贝数量的测序模板；（3）测序，目前NGS测序平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system，其中Illumina公司的测序平台占主导地位。Roche/454 FLX平台采用焦磷酸测序原理，在第二代中读长最高，但仪器昂贵，难于处理重复和同种碱基多聚物区域；SOLID平台应用连接法测序，测序通量和准确性高，试剂成本低，但仪器昂贵，测序运行时间长，读长短，数据分析困难。Solexa技术采用可逆链终止物和合成测序法，测序通量高，需要样品量少其简单、快速、自动化，其但仪器高贵，用于数据删节和分析的费用很高。
NGS技术的原理和流程
资料来源：公开资料，宽华投研团队整理
5.3.2非靶向测序
非靶向测序根据检测范围分为全外显子测序(WES)和全基因组测序(WGS)。目前已有技术平台应用全基因组测序方法来分析ctDNA，该方法能够在不事先知道肿瘤中可能存在的畸变的情况下鉴定肿瘤特异性的改变。因此，可以利用这些方法从头发现治疗抗性的基因变化，并鉴定癌症患者中新的可操作靶标。但是全基因组测序检测灵敏度较低（5-10%），而且成本高、检测周期长、数据分析难度较大，难以在临床上应用。
5.3.3靶向深度测序
为了在保证检测准确性和测序深度的基础上降低价格，目前越来越多的新技术先对ctDNA目的片段进行富集，再将富集后的目的序列进行深度测序，这种方法称为靶向深度测序。与全基因组测序以及全外显子测序相比，靶向测序能够获得更深的覆盖度和更高的数据准确性，提高了对目的区域的检测效率。同时缩短了检测周期，降低了测序成本，适合对大量样本进行分析。
靶向测序技术可通过PCR或杂交捕获对目的片段进行富集。基于PCR的靶向测序技术是针对目的基因设计几十对甚至上百对PCR引物，利用PCR扩增富集。基于杂交捕获的靶向测序技术是针对目的基因设计探针，通过杂交捕获的方法富集。
由于NGS的实验流程技术较为复杂，在文库构建、目的片段富集及测序过程中不可避免的会引入一些扩增和测序的错误，这些错误称为背景噪音，而ctDNA检测往往突变频率较低，受到背景噪音干扰较大，来自ctDNA样本中的低频突变往往淹没在背景噪音之中，造成假阴性或假阳性结果，这就限制了ctDNA检测的灵敏度和特异性。因此，目前基于NGS的靶向测序技术都致力于降低背景噪音，提高ctDNA检测的灵敏度和特异性，大多数技术通过分子条形码(barcode)的策略。分子条形码又称分子标签(Unique Molecular indentifier, UMI)，它的原理就是给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样，根据不同的标签序列就可以区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的突变，从而改善检测的局限性，提高测序的准确性。最初使用的条形码策略是追踪单链DNA的单链标签，目前大多使用的策略是追踪双链DNA的双链标签。尽管双链标签比单链标签能实现更好的错误抑制，但是效率相对较低，因此对于临床上数量有限的cfDNA不是最佳的。
使用分子条形码策略的NGS方法
资料来源：N Engl J Med 2018;379:1754-65，宽华投研团队整理
除了使用分子条形码，一些错误抑制算法和富集特定长度的ctDNA片段（ctDNA片段通常比健康细胞释放的cfDNA片段小）也被用来降低背景噪音，改善ctDNA检测的敏感度。
目前通过靶向深度测序方法进行ctDNA检测的主要技术有标记扩增深度测序(TAM-Seq)，安全测序系统(Safe-seqS)，癌症个体化深度测序(CAPP-Seq)，集成数字错误抑制方法(iDES)，靶向错误矫正测序(TEC-Seq)等。
TAM-Seq 基本原理是设计特异性引物对目标区域进行循环预扩增，产生大小200bp以下末端重叠覆盖整个区域的扩增子（预扩增），接着通过单重PCR选择性扩增带突变的扩增子区（标签扩增），从而排除非特异性产物，最后在回收的产物上加接头和特异性条形码(barcode)，进一步通过单端测序得到最终结果。该方法主要特点是测序通量高、测序时间和成本显著降低，但检测敏感度有待提高（>2%）。
TAM-Seq流程（红星代表携带突变的DNA分子）
资料来源：Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012)，宽华投研团队整理
Safe-seqS 该方法包括两个基本步骤：第一步为每个待分析的DNA模板分子分配独特的标示物（UID，或称条形码）；第二步对每个UID标记的模板进行扩增，从而产生具有相同序列的许多子分子（定义为UID家族）。如果用于扩增的模板分子中预先存在突变，则该突变应该存在于含有该UID的每个子代分子中（除非任何后续的复制或测序错误）。至少95％的家庭成员具有相同突变的UID家族被称为“超级突变体”。原始模板中没有发生的突变，例如复制或测序错误，不会产生超级突变体。Safe-seqS改善了大规模平行测序的准确性，能用于鉴定DNA模板中的稀有突变，发现PCR或测序过程中产生的错误。UID标记的模板的扩增效率对该方法的成功至关重要，但临床样品含有降低该步骤效率的抑制剂，需要优化以解决这一问题。
Safe-SeqS流程
资料来源：PNAS. 2011 Jun 7; 108(23): 9530–9535，宽华投研团队整理
CAPP-Seq 该方法的关键是联合数据库检索和多阶段生物信息学方法，来设计一个由生物素化的寡核苷酸组成的“筛选器”，靶向肿瘤的突变区域，直接应用于待测的循环DNA，来识别肿瘤相关的基因突变，从而直接进行ctDNA的定量测定。这个筛选器是从肿瘤基因突变数据库（COSMIC）等来源中，纳入可能的驱动基因中反复出现突变的外显子，再对肿瘤基因图谱库（TCGA）的407名非小细胞肺癌（NSCLC）患者的全外显子测序数据，运用迭代算法找到最大量的错义突变，而使筛选器长度最小化。筛选器长度约为125kb，包含了139个反复出现的突变基因中的521个外显子及12个内含子，平均能够识别4个单核苷酸突变。CAPP-Seq有效的把测序区段浓缩到整个基因组大小的0.004%，使得后续超高深度测序得以实现，其对ctDNA检测结果灵敏度高，特异性强且经济可行。
CAPP-Seq流程
资料来源：维基百科，宽华投研团队整理
iDES CAPP-seq技术的检测极限是0.02%，不过许多测序片段都有错误。为了解决这些错误，研究人员对CAPP-seq进行了优化，开发了iDES。该方法使用分子条形码和“背景抛光”两种技术策略，能获得有效的cfDNA，大大降低了本底噪音。这两种方案能分别使CAPP-seq敏感性提升3倍，而结合后提升15倍。
iDES使用的分子条形码策略综合了单链条形码和双链条形码的各自优势。原始DNA双链分子的每条链使用四个条形码标记。单链条形码为“索引读取”的一部分进行测序，因此称为“索引”条形码。双链条形码作为插入DNA片段主要读数的一部分进行测序，因此称为“插入”条形码。在测序之后，互补的插入条形码可匹配，从而重新构建出原始的双链DNA分子。
iDES分子条形码的设计策略
资料来源：Nat. Biotechnol. 34, 547–555 (2016)，宽华投研团队整理
杂交捕获过程中的氧化损伤会产生大量反复发生的背景错误，最常见的是G→T的颠换，也有少量C→T和G→A的错误。仅使用分子条形码策略，这些背景错误的发生率仍较高。为了减少基于杂交捕获的测序技术产生的背景错误，研究人员设计一种称为“背景抛光”的计算方法。iDES将这种计算方法与分子条形码策略结合起来，使错误率减少了15倍。
iDES能够检测到频率低至0.004%的突变，敏感性和特异性较其他方法得到了改善。在热点等位基因上实现了与数字PCR或基于PCR的测序方法类似的灵敏度，但可以同时询问数百到数千个额外的基因组位置，而不会影响灵敏度或特异性。
TEC-seq 该方法基于对基因组的多个区域的靶向捕获和DNA片段的深度测序(~30,000X)。除了深度测序以外，该方法还对测序流程做出了一系列改进来提高检测的灵敏度。其中包括：优化测序库的生成和靶向片段的捕获，通过加入少量外源条形码最大化独特ctDNA在测序库中的呈现可能，以及在后期分析时过滤掉测序错误和其它原因导致的基因变异。TEC-seq检测有望用于无症状的患者进行癌症早期筛查，但鉴于可能潜在检测到的不同肿瘤，需要成像和其他诊断手段来完成任何阳性ctDNA分析，以适当鉴别起源肿瘤。
TEC-seq流程（从血液中提取cfDNA，并通过连接含有少量双索引条形码适配子的池转化为基因组文库。捕获所得到的cfDNA文库并进行冗余测序以产生每个DNA片段的多重拷贝。重复片段之间的序列调节鉴定出具有相同起始和终止位置以及外源条形码的相同DNA分子中存在的改变。使用包含相同冗余变化的多个不同分子的参照基因组进行比对以鉴别真正的改变）
资料来源：Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012)，宽华投研团队整理
5.4核酸质谱技术
20世纪80年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究。由此其奠基人田中耕一和约翰贝内特芬恩于2002年获得诺贝尔化学奖，FDA于2014年批准MALDI-TOF MS可用于临床核酸检测。MALDI TOF质谱通过将待测样本转换成高速运动的离子，根据不同离子拥有不同的质荷比(m/z)，来对待测样本进行分离和检测，可用于ctDNA的SNP、突变、甲基化及拷贝数差异等多项检测与分析。
Agena是采用飞行质谱技术进行核酸检测最知名的公司，目前已经与多家公司合作，对公司的MassARRAY®系统、DNA检测应用和产品进行大力推广。MassARRAY®系统将飞行质谱的特性和多重基因检测完美的组合在一起，一次检测多达40~50个基因位点，单位成本低廉，这是其在临床应用的核心竞争力。
飞行质谱检测核酸突变的原理（首先通过多重PCR同时扩增多个待测基因突变和野生的目的片段，然后通过单碱基延伸反应获得突变片段的延伸产物，延伸产物和非延伸引物与芯片基质共结晶，用激光照射后产物离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而测定离子的质荷比（m/z），从而确定该位点的碱基。）
资料来源：言行生物官网，宽华投研团队整理
5.5EFIRM技术
EFIRM全称Electric Field-induced Release and Measurement(电场诱导的释放与检测技术)。该技术由易活生物完全掌握，其创造性地采用超高活性分子探针固定、电场瞬间捕获靶标分子、捕获分子信号特异放大三大核心专利技术，从而实现无需核酸提取、无需PCR扩增，直接检测靶标分子。已有研究表明，利用EFIRM技术可从早期和晚期非小细胞肺癌患者的血液或唾液样本中准确检测出EGFR基因突变。
与PCR和二代测序相比，EFIRM的技术核心在于电场诱导，它的优势是检测时间短(30-60 min，其他技术检测可能要数天时间)、操作便捷(可实现半自动和全自动检测，对技术人员操作要求低)、成本低(价格是目前诊断方法的十分之一)。此外，除了检测DNA等核酸分子，EFIRM技术还能检测蛋白质分子。但是该方法目前仅完成了EGFR基因突变的检测，需要增加分析突变的数量并进一步提高灵敏度以促进大规模筛查。
EFIRM技术检测EGFR突变的原理（设计针对EGFR突变的成对探针（捕获探针和检测探针），捕获探针固定于电化学传感器金电极表面的导电多聚物上，检测探针用荧光素标记。将血液或唾液样品与探针混合，在循环方波电场（csw E-field）作用下，捕获探针通过碱基互补作用与样本中的靶标序列结合。在反应液中加入抗荧光素抗体偶联的辣根过氧化物酶（HRP）和HRP的底物四甲基联苯胺（TMB）。在电场作用下，HRP与检测探针结合并和底物TMB发生反应，产生电信号。通过测量电信号即可检测EGFR的突变情况）
资料来源：Am J Respir Crit Care Med. 2014 Nov 15;190(10)，宽华投研团队整理
（来源：金氪投行之家的财富号 2018-12-29 10:59） [点击查看原文]
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