原理
童鞋们应该还记得western中提到的检测原理,蛋白-一抗-二抗三个小伙伴手拉手,如果可以用试剂检测到二抗,那么就能够间接地检测到蛋白。其实免疫组化(包括免疫荧光,也包括ELISA)的原理与之类似,也是先用一抗识别蛋白,然后用二抗识别一抗,最后用底物与二抗上连接的酶反应并显色(免疫荧光的二抗自带荧光,所以不用与底物反应显色;有些ELISA的识别过程会稍微繁琐一点点)。但是,与western不同的是:
western中的蛋白通过“转膜”被结合在一张膜上,而免疫组化的蛋白是在组织上,因此免疫组化中所要检测的蛋白无需提取,只需要将组织进行简单处理即可。免疫组化的这一特点同时也成就了它被很多人青睐的原因,就是“眼见为实”,通过免疫组化的方法可以在组织“原位”将蛋白现形,免去了组织和细胞处理、蛋白提取等诸多过程对样本外形的破坏,起到“定位”的效果;
western中用到的蛋白样本是经过“变性”处理的,也就是我们要把从组织或细胞中提到的蛋白与loading buffer混合后“煮一煮”的(非变性电泳除外),所以western中的蛋白样本没有蛋白质高级结构,但是免疫组化中的蛋白样本是具有高级结构的,这将对一抗的选择有一定要求,详情请参见“小贴士”第1点。
操作
总体上,免疫组化的操作包括7个步骤:组织固定(可选)、石蜡包埋(做石蜡切片的选择做,做冰冻切片的请跳过)、切片、蛋白复性(未固定的冰冻切片请跳过)、封闭、抗体孵育、显色。细心的你可能发现了一个问题,做免疫组化可以有石蜡切片和冰冻切片两种选择,那究竟该怎么选择?首先我们先来解释一些基本问题:既然免疫组化是在组织上做的,那么这个组织得把它盛放到一个载体(或者你豪放地理解为容器也行)上才能操作,因为我们不能生猛地用手或者用镊子拿着组织来做免疫组化,这个载体就是一张载玻片,但不是普通载玻片,而是防脱玻片(请参见“小贴士”第2点),一般就是用多聚赖氨酸处理过的普通玻璃载玻片。而在载玻片上的组织也不是块状的,而是经过切片机切片后的组织薄层。因此这就带来了一个操作,叫做切片。
切片是用切片机完成的,市面上的切片机有两种:石蜡切片机和冰冻切片机,顾名思义,他们可以分别完成石蜡切片和冰冻切片(好吧,这句话说了等于没说)。其实做石蜡切片还是冰冻切片的决定因素不是切片机,恰恰相反,你用什么切片机倒是由你想做哪种切片决定的,而你想做哪种切片则是由一抗决定的。比如你想用免疫组化检测A分子,首先要买可以用来做免疫组化的anti-A抗体(一抗),这个抗体本身的性质决定了它是可以用于做石蜡切片还是冰冻切片(说明书上有)。如果是做石蜡切片,首先把样本固定,然后用石蜡把样本包埋起来,切片的时候连组织带石蜡一起切;如果是做冰冻切片,样本固定不固定均可,无需包埋,仅仅是在切片前需要把样本埋在一种叫做O.C.T.胶的东西里面,冷冻了以后,连组织带胶一起切。通过切片机得到盛放在(贴在)防脱玻片上的组织薄层,然后再在这个薄层上对组织进行免疫组织化学染色(最后真的会出现肉眼可见的颜色),这个过程就是所谓的“免疫组化”。(两种切片机请见下图)
石蜡切片
冰冻切片
好了,本侠觉得该交代的基本情况都交代完了,下面我们就来说说免疫组化的具体操作。
第一步:组织固定(新鲜样本的冰冻切片可以跳过)说到这里,本侠猜到你可能有点懵圈儿,懵什么圈儿呢?本侠再猜,1、什么是固定?2、为什么需要固定?3、为什么不是所有样本都要固定,有些样本可以不固定?好,慢慢来捋。
首先,固定是通过将样本泡在甲醛或多聚甲醛(俗称固定液,浓度请参见“小贴士”第4点)里,使得组织里的蛋白质空间结构上形成“甲基桥”,这样的蛋白质不易被降解,因此能长期保存。其次,对蛋白质、核酸、无机分子进行检测,其实是越直接越好,也就是检测之前对样本的处理越少越好,因为我们不能保证这些处理试剂的引入对检测对象的含量没有影响,在免疫组化中,固定液其实就是这样一种处理试剂。那么问题来了,既然可能对检测造成影响,为什么还要固定?原因是我们很多时候取完样本不能马上进行免疫组化检测(比如还有其它实验要同时进行,而那些实验必须在样本得到以后马上进行),这个时候天降了一种操作叫做“你可以把组织先固定起来,以后再做免疫组化”,我们当然欣然接受。不过这也从侧面反应出一个问题,就是固定对于免疫组化结果的影响可能还好。最后,既然不固定显得很“天然”,那么就不固定好了,安排实验的时候尽量把时间都安排给免疫组化就可以了。实际情况是,不固定的样本只能用来做冰冻切片,因为石蜡切片需要事先把组织包埋在石蜡块里面,而包埋的这个过程有如上刀山下油锅,需要经历种类繁多的有机试剂的处理,最后还要熬得过60度左右的高温(原因是样本需要在石蜡呈液态的时候被包埋进去),因此样本别无选择地只能先固定。按照前面的说法,如果你需要检测的蛋白,它的抗体只能用来做石蜡切片,那你连选择固定不固定的权利都没有,必须固定样本。反过来,如果你的抗体可以用来做冰冻切片,那么恭喜你,你可以选择固定样本,也可以选择不固定样本。
阶段性总结一下啊,决定做免疫组化了,选择做石蜡还是冰冻,先查一下抗体,根据抗体选择做哪种切片。抗体选好了以后,如果做石蜡,需要固定样本;如果做冰冻,固定不固定看你有没有时间马上做组化,so easy!
做好了选择,下面就是如何固定的问题了。按照本侠的经验,固定这一步对于石蜡切片和冰冻切片并没有本质区别,只是有两种常用的不同级别的固定操作,本侠把这两种级别定义为“傻瓜型”和“技术型”。“傻瓜型”真的很傻瓜,傻瓜到就像“把大象放冰箱”,第一步配固定液,第二步取一小块组织(怎么取请参见“小贴士”第5点),第三步把组织丢到固定液里面,搞定!“技术型”就真的需要点技术了,这种固定方法需要对组织进行灌注固定,由于讲解灌注固定需要一定篇幅,所以如果有小伙伴想知道如何灌注固定,可以到网上搜索方法,也可以留言私下交流。一般而言,“傻瓜法”即可满足要求,取一根15ml离心管(不用无菌,用过洗干净的都行),里面倒上7/8ml固定液,剪一小块组织丢到固定液里,盖上盖子即可。关于固定的时间,没有严格的规定,五六七八个小时都行,呵呵呵。按说下一讲应该接着说第二步:石蜡包埋,可是真的很对不住大家,本侠没做过石蜡包埋,因为本侠所有的包埋操作都是请公司做的,为的是花钱能省时间。所以下一讲我们直接说第三步:切片。那么有小伙伴就要问了,切片你咋不请公司做,不也能省时间?想知道吗?下一讲告诉你为什么,嘻嘻嘻。
猪猪侠小贴士
1、关于免疫组化中一抗的选择,请大家避免选择跟样本同样来源的一抗。比如你做的样本是小鼠的,那么你的一抗就不要选小鼠来源的。这一点与western不一样,原因是western中的样本我们事先用SDS处理并用高温煮过了,这个样本是不具有蛋白质高级结构的,所以样本不会与接下来的二抗结合;而免疫组化中的蛋白是具有高级结构的,孵育完一抗以后再使用二抗,二抗除了能结合一抗,也可能结合样本中的蛋白。如果还以小鼠来源的样本为例,western中用小鼠来源的一抗识别了蛋白,再用anti-mouse的二抗去识别一抗的时候,由于二抗识别的是小鼠来源的IgG(拥有蛋白质高级结构),整个体系里除了一抗,不存在具有高级结构的蛋白能与二抗结合,所以western所用的一抗不受样本来源的限制。但是免疫组化样本就不一样,当用小鼠来源的一抗识别了蛋白,再用anti-mouse的二抗去识别一抗的时候,二抗除了能与具有高级结构的一抗结核,也能与具有高级结构的来自于样本的IgG结合(因为样本也是小鼠的),这样就造成了假阳性。
2、防脱玻片是做免疫组化必备的,不然你的样本还没等实验做完就掉光了。防脱玻片可以自己做,也可以直接买。现在很多公司都推出了各种防脱玻片,有普通的、强化的,大家可以根据自己的口味挑选,如果免疫组化做得不多,可以考虑买现成的。如果大家想要自己制作防脱玻片,可以用多聚赖氨酸处理,具体操作请问度娘,并不难。
3、细心地你可能还会发现,为什么切片总要把组织连着别的东西一起切?原因是组织就是一块肉肉,再快的刀也不能把一块肉完好无损地切到几微米薄,所以要在组织外面包一圈“助切剂”,当然,这是本侠的理解啦。
4、固定液的选择一般有两种。10%的甲醛和4%的多聚甲醛。10%的甲醛配起来很容易,购买市售的30%的甲醛,用PBS(更常用)或水稀释到10%即可。4%的多聚甲醛配起来麻烦一点,以配制100ml 4%多聚甲醛为例,称取4g多聚甲醛,导入250ml锥形瓶中,加80ml水,不用混匀,因为溶解不了,下一步用保鲜膜封口,皮筋扎紧,放到68℃水浴锅中加热2h,期间不时混匀以助溶解,完全溶解后,定容至100ml,记得,通风厨操作,比较够味。固定液常温保存,妥妥哒。
5、取组织的时候,首先小伙伴们自己要清楚实验目的是什么。根据实验目的选取脏器上合适的部位,如果不确定,可以多取几块。那么有人要问了,为什么不能把整个脏器都固定了?问的好,你怎么不把整个动物都固定了呢?固定液渗透进入组织是有能力限制的,所以组织不能取太大。那尽量取小一点行不行呢?答案是:也不行。因为取太小,做完实验,你想看的可能啥也看不到,因为没取对地方。其实这个问题需要经验来回答,没有标准答案。但是本侠可以给大家提供一个参考,第一次取,可以剪小指指甲面积、0.5cm厚度试试,有了经验以后可以慢慢调整大小。
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