原理
童鞋们应该还记得western中提到的检测原理，蛋白-一抗-二抗三个小伙伴手拉手，如果可以用试剂检测到二抗，那么就能够间接地检测到蛋白。其实免疫组化（包括免疫荧光，也包括ELISA）的原理与之类似，也是先用一抗识别蛋白，然后用二抗识别一抗，最后用底物与二抗上连接的酶反应并显色（免疫荧光的二抗自带荧光，所以不用与底物反应显色；有些ELISA的识别过程会稍微繁琐一点点）。但是，与western不同的是：
western中的蛋白通过“转膜”被结合在一张膜上，而免疫组化的蛋白是在组织上，因此免疫组化中所要检测的蛋白无需提取，只需要将组织进行简单处理即可。免疫组化的这一特点同时也成就了它被很多人青睐的原因，就是“眼见为实”，通过免疫组化的方法可以在组织“原位”将蛋白现形，免去了组织和细胞处理、蛋白提取等诸多过程对样本外形的破坏，起到“定位”的效果；
western中用到的蛋白样本是经过“变性”处理的，也就是我们要把从组织或细胞中提到的蛋白与loading buffer混合后“煮一煮”的（非变性电泳除外），所以western中的蛋白样本没有蛋白质高级结构，但是免疫组化中的蛋白样本是具有高级结构的，这将对一抗的选择有一定要求，详情请参见“小贴士”第1点。
操作
总体上，免疫组化的操作包括7个步骤：组织固定（可选）、石蜡包埋（做石蜡切片的选择做，做冰冻切片的请跳过）、切片、蛋白复性（未固定的冰冻切片请跳过）、封闭、抗体孵育、显色。细心的你可能发现了一个问题，做免疫组化可以有石蜡切片和冰冻切片两种选择，那究竟该怎么选择？首先我们先来解释一些基本问题：既然免疫组化是在组织上做的，那么这个组织得把它盛放到一个载体（或者你豪放地理解为容器也行）上才能操作，因为我们不能生猛地用手或者用镊子拿着组织来做免疫组化，这个载体就是一张载玻片，但不是普通载玻片，而是防脱玻片（请参见“小贴士”第2点），一般就是用多聚赖氨酸处理过的普通玻璃载玻片。而在载玻片上的组织也不是块状的，而是经过切片机切片后的组织薄层。因此这就带来了一个操作，叫做切片。
切片是用切片机完成的，市面上的切片机有两种：石蜡切片机和冰冻切片机，顾名思义，他们可以分别完成石蜡切片和冰冻切片（好吧，这句话说了等于没说）。其实做石蜡切片还是冰冻切片的决定因素不是切片机，恰恰相反，你用什么切片机倒是由你想做哪种切片决定的，而你想做哪种切片则是由一抗决定的。比如你想用免疫组化检测A分子，首先要买可以用来做免疫组化的anti-A抗体（一抗），这个抗体本身的性质决定了它是可以用于做石蜡切片还是冰冻切片（说明书上有）。如果是做石蜡切片，首先把样本固定，然后用石蜡把样本包埋起来，切片的时候连组织带石蜡一起切；如果是做冰冻切片，样本固定不固定均可，无需包埋，仅仅是在切片前需要把样本埋在一种叫做O.C.T.胶的东西里面，冷冻了以后，连组织带胶一起切。通过切片机得到盛放在（贴在）防脱玻片上的组织薄层，然后再在这个薄层上对组织进行免疫组织化学染色（最后真的会出现肉眼可见的颜色），这个过程就是所谓的“免疫组化”。（两种切片机请见下图）
石蜡切片
冰冻切片
好了，本侠觉得该交代的基本情况都交代完了，下面我们就来说说免疫组化的具体操作。
第一步：组织固定（新鲜样本的冰冻切片可以跳过）说到这里，本侠猜到你可能有点懵圈儿，懵什么圈儿呢？本侠再猜，1、什么是固定？2、为什么需要固定？3、为什么不是所有样本都要固定，有些样本可以不固定？好，慢慢来捋。
首先，固定是通过将样本泡在甲醛或多聚甲醛（俗称固定液，浓度请参见“小贴士”第4点）里，使得组织里的蛋白质空间结构上形成“甲基桥”，这样的蛋白质不易被降解，因此能长期保存。其次，对蛋白质、核酸、无机分子进行检测，其实是越直接越好，也就是检测之前对样本的处理越少越好，因为我们不能保证这些处理试剂的引入对检测对象的含量没有影响，在免疫组化中，固定液其实就是这样一种处理试剂。那么问题来了，既然可能对检测造成影响，为什么还要固定？原因是我们很多时候取完样本不能马上进行免疫组化检测（比如还有其它实验要同时进行，而那些实验必须在样本得到以后马上进行），这个时候天降了一种操作叫做“你可以把组织先固定起来，以后再做免疫组化”，我们当然欣然接受。不过这也从侧面反应出一个问题，就是固定对于免疫组化结果的影响可能还好。最后，既然不固定显得很“天然”，那么就不固定好了，安排实验的时候尽量把时间都安排给免疫组化就可以了。实际情况是，不固定的样本只能用来做冰冻切片，因为石蜡切片需要事先把组织包埋在石蜡块里面，而包埋的这个过程有如上刀山下油锅，需要经历种类繁多的有机试剂的处理，最后还要熬得过60度左右的高温（原因是样本需要在石蜡呈液态的时候被包埋进去），因此样本别无选择地只能先固定。按照前面的说法，如果你需要检测的蛋白，它的抗体只能用来做石蜡切片，那你连选择固定不固定的权利都没有，必须固定样本。反过来，如果你的抗体可以用来做冰冻切片，那么恭喜你，你可以选择固定样本，也可以选择不固定样本。
阶段性总结一下啊，决定做免疫组化了，选择做石蜡还是冰冻，先查一下抗体，根据抗体选择做哪种切片。抗体选好了以后，如果做石蜡，需要固定样本；如果做冰冻，固定不固定看你有没有时间马上做组化，so easy！
做好了选择，下面就是如何固定的问题了。按照本侠的经验，固定这一步对于石蜡切片和冰冻切片并没有本质区别，只是有两种常用的不同级别的固定操作，本侠把这两种级别定义为“傻瓜型”和“技术型”。“傻瓜型”真的很傻瓜，傻瓜到就像“把大象放冰箱”，第一步配固定液，第二步取一小块组织（怎么取请参见“小贴士”第5点），第三步把组织丢到固定液里面，搞定！“技术型”就真的需要点技术了，这种固定方法需要对组织进行灌注固定，由于讲解灌注固定需要一定篇幅，所以如果有小伙伴想知道如何灌注固定，可以到网上搜索方法，也可以留言私下交流。一般而言，“傻瓜法”即可满足要求，取一根15ml离心管（不用无菌，用过洗干净的都行），里面倒上7/8ml固定液，剪一小块组织丢到固定液里，盖上盖子即可。关于固定的时间，没有严格的规定，五六七八个小时都行，呵呵呵。按说下一讲应该接着说第二步：石蜡包埋，可是真的很对不住大家，本侠没做过石蜡包埋，因为本侠所有的包埋操作都是请公司做的，为的是花钱能省时间。所以下一讲我们直接说第三步：切片。那么有小伙伴就要问了，切片你咋不请公司做，不也能省时间？想知道吗？下一讲告诉你为什么，嘻嘻嘻。
猪猪侠小贴士
1、关于免疫组化中一抗的选择，请大家避免选择跟样本同样来源的一抗。比如你做的样本是小鼠的，那么你的一抗就不要选小鼠来源的。这一点与western不一样，原因是western中的样本我们事先用SDS处理并用高温煮过了，这个样本是不具有蛋白质高级结构的，所以样本不会与接下来的二抗结合；而免疫组化中的蛋白是具有高级结构的，孵育完一抗以后再使用二抗，二抗除了能结合一抗，也可能结合样本中的蛋白。如果还以小鼠来源的样本为例，western中用小鼠来源的一抗识别了蛋白，再用anti-mouse的二抗去识别一抗的时候，由于二抗识别的是小鼠来源的IgG（拥有蛋白质高级结构），整个体系里除了一抗，不存在具有高级结构的蛋白能与二抗结合，所以western所用的一抗不受样本来源的限制。但是免疫组化样本就不一样，当用小鼠来源的一抗识别了蛋白，再用anti-mouse的二抗去识别一抗的时候，二抗除了能与具有高级结构的一抗结核，也能与具有高级结构的来自于样本的IgG结合（因为样本也是小鼠的），这样就造成了假阳性。
2、防脱玻片是做免疫组化必备的，不然你的样本还没等实验做完就掉光了。防脱玻片可以自己做，也可以直接买。现在很多公司都推出了各种防脱玻片，有普通的、强化的，大家可以根据自己的口味挑选，如果免疫组化做得不多，可以考虑买现成的。如果大家想要自己制作防脱玻片，可以用多聚赖氨酸处理，具体操作请问度娘，并不难。
3、细心地你可能还会发现，为什么切片总要把组织连着别的东西一起切？原因是组织就是一块肉肉，再快的刀也不能把一块肉完好无损地切到几微米薄，所以要在组织外面包一圈“助切剂”，当然，这是本侠的理解啦。
4、固定液的选择一般有两种。10%的甲醛和4%的多聚甲醛。10%的甲醛配起来很容易，购买市售的30%的甲醛，用PBS（更常用）或水稀释到10%即可。4%的多聚甲醛配起来麻烦一点，以配制100ml 4%多聚甲醛为例，称取4g多聚甲醛，导入250ml锥形瓶中，加80ml水，不用混匀，因为溶解不了，下一步用保鲜膜封口，皮筋扎紧，放到68℃水浴锅中加热2h，期间不时混匀以助溶解，完全溶解后，定容至100ml，记得，通风厨操作，比较够味。固定液常温保存，妥妥哒。
5、取组织的时候，首先小伙伴们自己要清楚实验目的是什么。根据实验目的选取脏器上合适的部位，如果不确定，可以多取几块。那么有人要问了，为什么不能把整个脏器都固定了？问的好，你怎么不把整个动物都固定了呢？固定液渗透进入组织是有能力限制的，所以组织不能取太大。那尽量取小一点行不行呢？答案是：也不行。因为取太小，做完实验，你想看的可能啥也看不到，因为没取对地方。其实这个问题需要经验来回答，没有标准答案。但是本侠可以给大家提供一个参考，第一次取，可以剪小指指甲面积、0.5cm厚度试试，有了经验以后可以慢慢调整大小。
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