稀释涂布平板法计数活菌的方法简介

1问题的提出

“微生物数量的测定”是2017年高考考纲中新增加的内容，同时也是教学的重难点。稀释涂布平板法是对微生物计数的常用方法，用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。

但对菌落计数的结果处理往往成为学生的易错点。

经典例题：在从土壤中分离产脲酶细菌的实验中，将10g土壤样液梯度稀释，在3个培养基平板上均接种稀释倍数为10⁵的土壤样液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为42、200、256。则1g土壤样品中的细菌数量为  ▲  个。

很多学生得出的答案为：1.66×10⁸。同时，学生对于42这个数据如何处理存在疑问：是否需要舍弃？

如果需要舍弃，标准是什么？

2菌落计数的基本原则

2.1教材中的相关表述

在人教版高中生物学选修1《生物技术实践》中，对于稀释涂布平板法计数菌落有如此的表述：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。但是，若想当然地认为42、200、256三个数据均处于30~300范围之内，然后直接求平均值，再乘以稀释倍数，就会得出1.66×10⁸的错误结果。这也是很多学生产生错误的原因。

事实上，教材中的相关表述只是在说明可计数的菌落数量的适宜范围。某一稀释度下的3个平板中菌落数并不能简单地直接求平均值，还应该关注稀释度的设置以及计数结果的允许差。

2.2稀释度的设置及计数原则

为了确保有效活菌数的准确测定，在采用平板计数检测中，必须设3个稀释度且成梯度，每个梯度设3个重复。测定土壤中细菌的数量，一般选用10⁴、10⁵和10⁶倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用10³、10⁴和10⁵倍稀释；测定真菌的数量，一般选用10²、10³和10⁴倍稀释。

如果平板中菌落的数量太少，必然会导致计数误差太大；反之，如果平板中菌落数量过多，会造成计数上的困难。因此，国际上通用的菌落计数的基本原则，是以平板上出现30~300个菌落数的稀释平板为计数标准。同时要求，同一个稀释度重复3次的平板上菌落数标准差值应小于允许差值。也就是说，在平板计数检测中，如果同一稀释度下的3次重复菌落数虽然均处于30~300个范围之内，但数据相差较大，就需要舍弃。

2.3同一稀释度下3个重复的允许差值

标准差的计算公式如下：

  

式中：SD——标准差，x——同一稀释度任一平板菌落数，

——同一稀释度平板菌落平均值，n——同一稀释度平板重复次数。

平板菌落数的允许差值如表1。

由表1可知，如果平板上3次重复的菌落平均数较小，其允许的误差就小；反之，如果菌落平均数较大，则其允许的误差就大一些。若选一个适宜稀释度计数，则3个重复的标准差值应小于规定的允许差值。若3个重复的标准差值大于规定的允许差值，则无法正确计数，必须重新测定。

2.4对例题的进一步分析

根据标准差公式，对上述例题计算如下：

参照表1中菌落数的允许差值可以看出，平板菌落平均数166处于101~300之内，标准所允许差值为±≤50。但经计算得知，该稀释度下3个平板菌落数的标准差值±111已远超允许差值。因此，本次的计数结果不符合要求，无法正确计数，需要重做。

3拓展

为更好地理解和熟练掌握微生物平板菌落计数的数据处理方法，提供3组示例（表2）以供参考和借鉴。

——龚军辉.王晶,生物学教学2018年（第43卷）第2期