本文主要内容：
亚硝胺类基因毒性杂质作为关注队列类基毒，有着更加严格的限度标准，在药物申报过程中很难轻易绕过，即使你的体系中没有使用亚硝酸盐和仲胺。
亚硝胺类化合物存在两种主要共振形式：
产生强烈致癌性的原因是经过P450相关酶的代谢后产生活性烷基化物种，可以导致DNA、蛋白质大分子烷基化，造成交联损伤DNA突变等：
二、经典亚硝化方法
通常认为亚硝胺类化合物的产生是仲胺和亚硝酸试剂同时使用，在一般的评估过程中很多人也是仅仅将这两个条件同时存在作为形成亚硝胺的必要条件，不过这样会导致忽略掉其余一些形成途径。
1：不同胺的硝化
A：仲胺的亚硝化
含有二级胺的化合物和亚硝化试剂进行亲核反应得到：
二级胺不仅仅局限于脂肪仲胺，还包括酰胺、氨基甲酸、羟胺、肼、腙、脲和胍类化合物。
除了脂肪仲胺外，羟胺和肼具有一定的亲核性，其余酰胺类亲核性较差，反应活性弱，但是在一些特殊的条件下也可能高产率得到亚硝胺类化合物。
B：叔胺的亚硝化
三级胺如果N的α碳有质子，也能提供二甲胺产生亚硝胺类化合物。
反应经历了胺亚硝化，脱除NOH，水解，得到仲胺，之后按照仲胺的条件得到亚硝基化合物。
三级胺由于涉及到额外的脱烷基步骤，因此形成亚硝胺的活性较低。
通常条件下，仲胺反应活性是叔胺的1000倍，而且不同的烷基取代基可能涉及到不同的交叉亚硝胺化合物生成；
不通常的条件下，依赖于烷基取代基的种类，如果含有富电子的苄基取代基，反应活性大大提高，如二甲胺甲基吡咯和10eq的亚硝酸钠反应，3min得到95%的NDMA。
C：伯胺的亚硝化
相比较二三级胺，伯胺基本不会产生稳定的亚硝胺，产物一般是重氮化后脱除胺。因此伯胺产生亚硝胺的风险最低。
2：亚硝化试剂
亚硝化试剂主要包括5种：亚硝酸离子、亚硝酰卤化物、亚硝酸酯、三氧化二氮和四氧化二氮。
A：亚硝酸钠
亚硝化的活性试剂是NO+，因此亚硝酸根离子和亚硝酸不能有效反应，需要亲核性的试剂来活化，在PH较低的情况下，亚硝酸可以作为亲核试剂，得到N2O3或者脱水的NO+来进行亚硝化反应。
酸性水溶液中的硝化
该系列反应受PH影响较大，通常在2~5的范围之内，具体和胺的pKa值等有关：
叔胺需要更高的温度和更长的反应时间：
虽然酰胺类的活性较低，但是在特定的反应条件下也可以得到高产率的亚硝胺类化合物：
相比较酰胺类，羟胺和肼的反应活性明显提高，很容易得到亚硝胺：
肼可以直接得到亚硝酸肼，或者有双取代基的肼会发生裂解得到亚硝酸胺。
需要关注的是一些硝酸试剂如发烟硝酸中是含有亚硝酸的。
中性和碱性条件下的亚硝化
由上分析可知，在中性和碱性条件，很难发生亚硝化反应，但是如果体系存在醛类，形成较高活性的亚胺，亚硝酸根作为亲核试剂，也是可以得到亚硝胺。
B：烷基亚硝酸酯
亚硝酸酯很容易在酸性水环境中释放活性试剂，和亚硝酸盐的酸性条件下反应相似：
在碱性条件仲胺可以发生类似酯交换的反应，在碱性环境得到亚硝胺的速度小于酸性水环境：
C：硝基化合物
一些硝基试剂也能形成有效的亚硝化反应，比如溴代硝基甲烷、三氯硝基甲烷和四硝基甲烷。
在氧化剂或者卤化物盐催化的条件下，硝基甲烷也可以进行亚硝化反应：
可能的反应机理为：
硝基甲烷在DBU/Cu(OTf)2/O2体系中也可以进行亚硝化，涉及的机理可能是：
D：氮氧化物
氮氧化物中，一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)、三氧化二氮(N2O3)和四氧化二氮(N2O4)观察到可以进行亚硝化反应。
N2O3和N2O4活性较高，产生亚硝化和本身的异构有关：
在碱性条件下反应较为迅速，反应机理为：
一氧化氮需要和氧气结合才能发挥活性，氧化成二氧化氮然后聚合成活性亚硝化试剂：
除了氧气，碘单质也可以活化一氧化氮：
E：亚硝酰卤化物
一些活性较差的磺酰胺也可以用亚硝酰氯亚硝化：
F：其他亚硝胺试剂
一些文献中的冷门试剂也可以用来亚硝化，其中一些机理还没有得到完全阐释，而且应用并不广泛。
三、非经典亚硝化方法
这些方法的数据和机理研究还不充分，得到的亚硝胺有时也不是主要产物。
1：硝基胺的还原
使用还原剂还原，如果反应继续进行，可能得到肼。
硝基胍通过锌粉还原，1eq得到亚硝胺，过量得到肼：
硝基胺高温下也能自发降解成亚硝胺：
可能机理为：
2：肼的氧化
UDMH在空气中经历24h，生成1.3%的NDMA，一些金属可以催化该类反应。
机理为：
3：腙的臭氧分解
在臭氧存在的情况下，腙可以被氧化生成亚硝胺：
反应机理为：
4：有机金属参与亚硝化
将格式试剂加入到一氧化氮中可以得到亚硝基羟胺：
反应机理为：
格式试剂也可以直接还原硝基胺成亚硝胺：
5：其余路径
在铜催化剂存在下，烷基亚硝酸酯可以从芳基硼酸生成亚硝胺：
氮源为亚硝酸酯，在一些铜催化的chan-lam偶联中可能会产生亚硝胺副产物。
一些情况下，硝酸银也可以产生亚硝胺：
四、结论
本文提供的亚硝胺生成机理给基因杂质的研究工作提供了便利，利于全方位的评估药品中的风险；
同时又给基因杂质的研究工作提供了极大的不便利，现在的审评倾向于疑罪从有，即使有1%的几率也要100%的研究。
所以在亚硝胺的所有知识探索都可能是给自己挖的坑，提供了永无止境的亚硝胺杂质生成依据。
当然最终的目的还是要倾向于科学，即使亚硝酸钠和二甲胺呆在一起，没有满足足够的条件，也产生不出火花。所以就算冒着给自己挖坑的风险也要将亚硝胺的反应探索到极致，因为最终只有科学才能回归理性。
参考文献：Pathways for N-nitroso compound formation: secondary amines and beyond
DoI:10.1021/acs.oprd.0c00323
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