导语：2020年4月16日，来自美国加州大学旧金山分校的Theodore L. Roth等在Cell上发表了题为“Pooled Knockin Targeting for Genome Engineering of Cellular Immunotherapies”的研究文章。该研究通过文库敲入筛选的方法，向T细胞的TCR位点大片段敲入特定的标记文库序列，进而检测这些基因组工程化的T细胞在体外和体内对免疫抑制环境的适应性及抗肿瘤免疫功能是否有提高。最后，再结合单细胞测序的方法分析验证，从而鉴定出可以提高T细胞功能性的敲入序列。因此，该研究建立了一套可以用于高通量筛选和鉴定可以提高T细胞功能的敲入序列的方法，为基因组工程化的细胞免疫疗法提供了高效技术手段。
Alexander Marson
Associate Professor, Microbiology And Immunology，UCSF。
主要经历：
PhD training：Rick Young and Rudolf Jaenisch at the Whitehead Institute at MIT，Treg & ESC；
Internship and residency：Brigham and Women’s Hospital；
Infectious diseases fellow：UCSF
主要研究：
1，鉴定基因组风险变异如何影响免疫细胞功能；
2，基于CRISPR的工程化基因组的工具开发；
3，检测编码和非编码遗传变异如何影响人类免疫系统的关键过程；
4，基因组工程化的人T细胞用于肿瘤、自身免疫病及感染性疾病的细胞免疫治疗。Theodore L. Roth
MD/PhD Student, Marson Lab，UCSF。
主要经历：
In Dr. Dorian McGavern Lab：用活体双光子显微镜解析脑损伤免疫反应的关键步骤；
In Dr. Matthew Scott Lab：开发DNA组装的新型合成生物学方法。基因组工程化免疫细胞疗法，如TCR-T、CAR-T等，可用于某些肿瘤的治疗，该方法可分为两类：非定点靶向方法（病毒在基因组上随机整合）和定点靶向方法（基于CRISPR/Cas9的特定位点整合）。定点靶向方法更优。
CAR-T目前面临的困境：1）血液瘤效果好而实体瘤效果差；2）肿瘤的免疫抑制性微环境；3）实体瘤中的衰竭或功能失调。因此，下一代的工程化T细胞需要增强功能，克服这些困境。
策略之一：敲除T细胞内异质性的检查点通路。如anti-PD-1、anti-CTLA4；以及PD-1-KO with CRISPR/Cas9。
CRISPR/Cas9除了敲除已知靶点之外，也可以用于功能缺失性的筛选，并结合单细胞测序方法得到可用的未知靶点。
除了基因敲除性筛选外，基因敲入性筛选也可成为更好的一种策略。因为基于目前已有的大量T细胞信号及功能研究，我们可以得到很多候选基因可能可以增强T细胞功能。然而，我们目前却缺乏一种可以快速敲入这些候选基因并检测其对T细胞功能影响的方法。
建立一套可以对T细胞进行高通量敲入候选序列并检测其对T细胞功能影响的高效方法，为基因组工程化的细胞免疫疗法提供高效技术手段。
Fig 1：高通量定点敲入筛选方法的建立。
Fig 2：DNA插入片段文库的高通量插入筛选。
Fig 3：定点高通量敲入的人原代T细胞的环境适应能力筛选。
Fig 4：文库敲入筛选出的靶点的功能验证及其对体外肿瘤细胞杀伤能力的改善。
Fig 5：PoKI-seq：结合文库敲入筛选和单细胞测序。
Fig 6：体内PoKI-seq可以获取人原代T细胞在肿瘤微环境中的富集及状态。
Fig 7：高通量敲入筛选出的TGFbR2-41BB嵌合抗原受体可以改善体内实体瘤的清除。
多重靶向敲入：同一细胞内同时敲入多个片段，检测效果；
敲入片段长度要求及数量限制？
其他敲入位点？
其他候选敲入片段？
其他用于筛选的细胞类型和功能表型？
该研究建立了一套高通量定点敲入的快速筛选方法，该方法基于CRISPR/Cas9大片段敲入的手段，并结合单细胞测序技术，可以实现快速高通量筛选出能够提高T细胞功能的片段序列。
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