前言
尾静脉注射作为常见的给药方式，往期我们已经做过详细介绍，并附有专业的视频分析，直击从小鼠固定到注射的每个环节，那你是否想过尾静脉注射的具体机理呢？如果将注射的对象由药物换成质粒，是否可以实现基因在体内的高效表达呢？本期小编带你一起来解锁尾静脉注射质粒的新技能--流体动力学注射，畅聊那些你不知道的事！
1. 流体动力学注射的定义及特点
流体动力学注射(Hydrodynamic injection)是将大体积质粒DNA溶液经小鼠尾静脉快速注射入小鼠体内，进而获得转基因表达的方法。该方法[1]是1999年Liu等科学家建立起来的，它们发现与传统的局部注射方法[2]相比，经尾静脉大容积注射质粒可引起小鼠体内转基因的高度表达。这种质粒递送系统逐渐受到研究者的青睐，与病毒递送系统相比各有千秋。
2. 作用原理
流体动力学注射通过静脉注射使大体积质粒DNA溶液迅速进入体循环，导致心脏负荷过重，大量的液体淤积在肝脏，肝内压力升高，迫使肝窦内皮细胞窗增大，肝细胞膜出现暂时性小孔，质粒DNA随之进入肝细胞，进而表达目的基因（如图1）[3]。
图1：流体动力学注射质粒的工作原理
注射步骤：
流体动力学注射是将大体积（占小鼠体质量的8%～10%）质粒DNA溶液经小鼠尾静脉在5-8s内快速注射入小鼠体内的方法。具体操作方法与小鼠尾静脉注射基本一致，包括小鼠固定—扩张尾静脉—注射等3部分，可参考往期介绍：尾静脉很难打？其实是你忽略了这几点（内附独家视频）
尾静脉注射视频
但是在质粒注射中，为了实现基因在体内的高效表达，存在诸多影响因素，如下我们参考文献和实战经验，为大家列举出的注意事项：
3. 影响基因表达效率的因素
3.1 质粒的构象
2001年chen ZY等人[4]报道表明线性DNA（L DNA）与环形DNA(C DNA)相比目的基因的表达量可提高10-100倍，表达时间长达9个月。如果除去细菌骨架序列（LF DNA）不仅可以提高和延长转基因在体内的表达还极大的降低了机体的免疫反应（如图2）。
图2：不同形式DNA介导的hFIX在小鼠体内的表达情况（左图）；不同形式DNA在小鼠体内诱发炎症因子的情况（右图）
3.2 注射液的类型
2004年FengD等人[5]报道表明将质粒DNA溶于Ringer液时，基因表达水平最高，而且对肝脏的毒性最小，可能是Ringer液中的CaCl2使DNA更容易进入细胞内。而质粒DNA溶解于PBS或生理盐水则基因表达水平相对较低，且对肝脏的毒性较大（如图3）。如果在生理盐水溶液中加入聚乙二醇，可以使进人肝细胞内的质粒DNA更稳定，而且能够提高完整质粒DNA传送到细胞核的效率。
图3：用不同注射液流体动力学注射质粒8h后，血液中谷丙转氨酶的的含量（左图）。用不同注射液流体动力学注射质粒8h后, hFIX在小鼠体内的表达情况（右图）
3.3 质粒注射液的体积
质粒注射液的体积是影响基因在不同组织中表达的关键因素，研究者以luciferase作为报告基因，分别选择了质量为11-13g, 18-20g, 30-33g的小鼠，通过尾静脉注射等质量不同体积的质粒，结果表明当注射液体积占小鼠体质量的8%～10%时，转基因的表达效果最佳（如图4所示)。
图4：质粒注射液的体积与基因在肝脏、肾脏、脾脏、肺和心脏中表达的关系
3.4 注射时间
注射时间也影响转基因的表达水平，最佳的注射速度为3-8秒（如图5所示），超过15秒时则转基因表达很低甚至检测不到。但是注射体积越大，注射速度越快时，引起的肝脏损伤也越严重，所以合理控制注射时间至关重要。
图5：注射时间对质粒在不同组织中表达水平的影响
3.5 动物的状态
动物状态也影响转基因的表达，当动物处于麻醉状态时进行流动动力学注射，有助于转基因的表达。因为麻醉状态下，心率减慢，心输出量降低，快速注射后导致更多的DNA溶液返流到肝脏，对小鼠肝脏的毒性却不增加。除此之外，动物的性别和系别也可能在某种程度上影响转基因的表达，有文献报道同等情况下雌性小鼠的表达量比雄性小鼠高，ICR品系比C57品系的表达量要高。
Tips: 转基因在8—24小时左右达到表达量的高峰后迅速下降，其原因可能与质粒DNA转移到肝脏后的两个时期有关。1-3天转基因表达快速丢失，4-7天后则缓慢下降，所以根据实验目的合理把握检测时间点非常重要！
4. 应用
除DNA外，此方法已成功应用多种大分子物质的递送，比如将RNA、蛋白甚至病毒等递送到动物体内，广泛应用于基因功能测试[6]、基因治疗[7]以及肝癌模型的建立等研究[8-9]。
5. 安全性
流体动力学注射质粒后，由于注射液的体积较大，小鼠的体重会快速增加，但4-10小时后即可恢复正常。临床生化指标检测表明血液中Na 、K 、Cl-及总蛋白浓度均在正常范围内。虽然血清中ALT水平短暂性升高，但是3天后即可恢复正常，这种对肝脏的损害与注射的质粒和基因产物无关。形态学观察发现，流体动力学注射后约5%的肝细胞受损，肝组织中可见出血和坏死灶。注射后4天，肝脏内单核细胞聚集增生，小鼠的肝脏逐步恢复正常。
综上所述，流体动力学注射是一种相对安全有效的基因递送方式，质粒DNA进入小鼠肝脏细胞后以游离体形式存在，不与染色体整合，消除了扰乱内源基因表达的后顾之忧。
6. 展望
随着人类基因组计划的完成，对基因功能的研究愈发重要。在体内基因功能研究中，基因递送方法的选择是至关重要。非病毒载体具有其他载体系统无法比拟的优点，有着广阔的前景。虽然流体动力学注射在各种实验中得到了转基因的高水平表达，而且可以借助于导管来完成注射，但是要将该方法应用于临床仍有大量工作要做。相信随着研究的不断深入，流体动力学注射有望取得突破性进展，成为安全、简便、有效的基因递送方法。
参考文献
1. Liu F, Song Y K, Liu D. Hydrodynamics-basedtransfection in animals by systemic administration of plasmid DNA[J]. Genetherapy, 1999, 6(7): 1258.
2. Wolff J A, Malone R W, Williams P, et al. Direct genetransfer into mouse muscle in vivo[J]. Science, 1990, 247(4949): 1465-1468.
3. Kamimura K, Yokoo T,Abe H, et al. Image-guided hydrodynamic gene delivery: current status andfuture directions[J]. Pharmaceutics, 2015, 7(3): 213-223.
4. Chen Z Y, Yant S R, He C Y, et al. Linear DNAs concatemerizein vivo and result in sustained transgene expression in mouse liver[J].Molecular Therapy, 2001, 3(3): 403-410.
5. Feng DM, He C X, Miao C Y, et al. Conditions affecting hydrodynamics‐based genedelivery into mouse liver in vivo[J]. Clinical and experimental pharmacologyand physiology, 2004, 31(12): 850-855.
6. Kawano F, Okazaki R, Yazawa M, et al. Aphotoactivatable Cre–loxP recombination system for optogenetic genome engineering[J].Nature chemical biology, 2016, 12(12): 1059.
7. Arad U, Zeira E, El-Latif M A, et al.Liver-targeted gene therapy by SV40-based vectors using the hydrodynamicinjection method[J]. Human gene therapy, 2005, 16(3): 361-371.
8. Chen X, Calvisi D F. Hydrodynamic transfectionfor generation of novel mouse models for liver cancer research[J]. The Americanjournal of pathology, 2014, 184(4): 912-923.
9. Xue W, Chen S, Yin H, et al. CRISPR-mediateddirect mutation of cancer genes in the mouse liver[J]. Nature, 2014, 514(7522):380.
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