编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。
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研究表明，肠道菌群失调与非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfatty liver disease, NAFLD)进展为晚期纤维化和肝硬化密切相关。为了进一步确定上述关联在临床上的诊断能力，研究比较了163名来自对照和患病家庭成员的粪便微生物组，包括非NAFLD患者、NAFLD合并肝硬化患者及其一级亲属。通过对宏基因组和非靶向代谢组使用随机森林机器学习算法和差异丰度分析，确定了用于检测肝硬化有效的独立的宏基因组和代谢组标志物(诊断准确率[AUC]: 0.91)。结合年龄和血清蛋白水平的宏基因组特征，可准确区分在生理上和遗传上不同的队列中的肝硬化。血清天冬氨酸氨基转移酶水平在肝硬化患者中升高，使得肝硬化与早期纤维化的区分成为可能。上述发现表明，肠道微生物中的核心物种可能作为肝硬化的一种具有普适性的无创式诊断标准。该研究对在高危个体中对晚期纤维化或肝硬化进行基于粪便的诊断测试奠定了基础，这对目前该领域来说是一个重要的进步，因为由于血清标记物的准确性有限以及磁共振成像等影像学技术的可获得性和检测成本的限制，使得肝硬化的早期诊断仍然面临挑战性。快速、廉价的方法对于肝硬化患者的诊断十分重要。该研究发现的这种通用的肠道微生物组衍生的标志物，可以准确地识别肝硬化，这对改善疾病诊断具有巨大的潜力，特别是在医疗资源有限的情况下。此外，对致病和有益肠道微生物种类的进一步筛查和鉴定也有助于开发针对NAFLD的新的治疗策略。
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实验设计
这项研究中，研究人员纳入了163个来自健康和NAFLD肝硬化患者及其家庭成员的粪便样本来筛查出能指示肝脏疾病的微生物相关的标志物，分别采用MetaPhlAn2宏基因组分析和HUMAnN2代谢网络分析对粪便样本进测序，来确定微生物群落组成及代谢途径丰度的变化。接着，将筛选鉴定出的微生物物种与患者的临床数据进行关联分析，利用机器学习来构建基于微生物特征的诊断模型。该研究还对关键的差异微生物种类和代谢物进行了的相关分析，利用机器学习和差异丰度相结合的方法筛选到17种代谢物，使其相结合能够准确地检测出NAFLD肝硬化。最后，研究者分别在51名非NAFLD、21名无进展纤维化的NAFLD患者、3名NAFLD相关纤维化患者和7名NAFLD-肝硬化患者的一级队列，同时结合已发表的不同地域和宿主遗传背景的相关研究中的队列数据中再次验证了该模型的诊断准确性。
结果
本研究的前瞻性队列包括163名受试者，包括NAFLD对照组、NAFLD肝硬化患者以及他们相应的一级亲属，表1中列出了整个队列的临床特征信息。在UCSD的先证者队列中，包括27名前瞻性招募的NAFLD肝硬化患者(81.5%女性；16名代偿性肝硬化患者，11名失代偿性肝硬化患者)和54名没有肝脏疾病的非NAFLD对照组(72.2%女性)。NAFLD的诊断是基于美国肝病研究协会(American Associationfor the Study of Liver Diseases, AASLD)的指南，通过肝脏活检或成像来确认的。对照组平均年龄(45.9±19.9)低于NAFLD-肝硬化组(64.7±9.8)岁，体重指数(26.1±6.8)kg/m2低于NAFLD-肝硬化组(32.8±10.1)kg/m2。患者详细病理资料如表1所示。
磁共振成像(MRI)技术用于诊断肝脏表型，包括MRI质子密度脂肪分数(MRI proton densityfat fraction, MRI-PDFF)检测肝脏脂肪含量和磁共振弹性成像(magneticresonance elastography, MRE)测量肝脏硬度作为纤维化的相关性。与对照组相比，NAFLD肝硬化组的肝脏脂肪含量(2.4%±0.9%vs 5.2%±4.1%，p<0.001)和肝脏硬度(2.13±0.37kPavs 5.04±2.68kPa，p<0.05)显著升高。
研究者分别采用宏基因组系统发育分析(metagenomicphylogenetic analysis, MetaPhlAn2)和HMP代谢分析网络分析 (HMP unifiedmetabolic analysis network 2, HUMAnN2)对粪便样本进测序，确定不同组别的肠道微生物群落组成和微生物代谢途径丰度变化。该研究总共鉴定了356个物种的1,216,335个基因家族和组装序列，去除未注释物种后，在163个患者样本中鉴定出310个微生物物种，隶属于53个科和115个属(图1A)。此外，使用Simpson指数来衡量微生物的丰富度，发现与对照组相比，NAFLD肝硬化患者的a-多样性显著降低，这与之前的研究报导相一致(图1B)。之前的研究报道，由于多种原因导致的肝硬化患者也存在类似的肠道菌群失调状态(图1B)。有趣的是，NAFLD肝硬化患者的a-多样性与临床参数相关，包括低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein, LDL)水平，凝血酶原时间(prothrombintime, PT)和国际标准化比率(internationalnormalized ratio,Inr)测定的凝血功能，以及胰岛素水平反映的葡萄糖稳态。此外，使用主坐标分析(principalcoordinate analysis, PCoA)结合weightedUniFrac算法，NAFLD肝硬化和NAFLD两组之间可以明显分离，说明b-多样性发生改变(图1C)。
在分类学水平上，NAFLD肝硬化患者和对照组肠道微生物群落的差异主要集中在从门到科。NAFLD肝硬化患者菌群最显著的成分是Negativicutes的增多和Clostridia的减少(图1D)，这些类别水平的变化与之前对多种原因的NAFLD或肝硬化引起的晚期纤维化患者的菌群的研究是一致的。
图1 NAFLD肝硬化组与NAFLD对照组肠道菌群的变化分析。(A)研究概述：研究队列、样本收集以及粪便宏基因组学和代谢组学分析。(B) a-多样性分析发现NAFLD-肝硬化组(N=27)与非NAFLD对照组(N=54)相比，肠道微生物多样性显著降低。在中国和意大利之前的队列研究中，非NAFLD对照组与NAFLD-肝硬化组患者之间的a-多样性也有显著性差异(p<0.001)。(C) PCoA分析表明，使用weighted-UniFrac距离算法，NAFLD肝硬化组和非NAFLD对照组的粪便样本之间有显著的离散。(D) 堆积条形图描述了NAFLD-肝硬化组和非NAFLD对照组之间肠道微生物组成的等级差异。“other”包括viruses, fungi和rare species (<1%)。(E)预测NAFLD肝硬化的核心差异微生物种类的相对丰度。(F) 使用UCSD队列中的19种判别物种(包括27例NAFLD肝硬化和54例非NAFLD对照组粪便样本)的RF模型的ROC曲线图。
3 基于宏基因组学的NAFLD肝硬化患者肠道微生物的特征
在本研究中，研究者发现与NAFLD肝硬化相关的肠道微生物种类和临床数据之间存在显著的相关性。在筛查确认的310个微生物物种中，108个与先证队列中的宏数据显示出显著的相关性。例如，Veillonella parvula的丰度与白蛋白和血小板计数呈负相关，在肝硬化患者各项参数降低(图S2)。相反，在对照组中富集的物种，包括Eubacteriumeligens，与白蛋白和血小板计数呈正相关。在患者中改变的某些微生物物种与临床数据之间的关联分析表明，肠道微生物的变化在一定程度上可能表明疾病状态。为了进一步探索这一假设，研究者利用随机森林(randomforest, RF)机器学习来识别NAFLD-肝硬化中的关键差异物种。具体地说，通过使用DESeq2工具检测到不同丰度的微生物种类，并通过使用RF分类器进行特征选择来识别NAFLD-肝硬化的微生物特征。值得注意的是，该方法识别了包含19个差异物种的肠道微生物组特征，准确地检测出先发性肝硬化([AUC]为0.91，图1E和1F)。
该研究识别出的微生物相关标志物包括Veillonellaparvula, Veillonella atypica, Ruminococcus gnavus, Clostridium bolteae,以及 Acidaminococcus sp水平的增加。D21伴随着Eubacterium eligens, Eubacterium rectale 和Faecalibacterium prausnitzii丰度的下降(图1E)。值得注意的是，尽管Veillonella parvula的丰度很低，但它是与NAFLD肝硬化相关的最具差异性的不良物种。Acidaminoces sp.隶属于Negativicutes纲，其在NAFLD肝硬化患者的丰度是对照组的15倍。相反，Eubacterium rectale和Faecalibacterium prausnitzii 的丰度随NAFLD的严重程度而降低，并且其在之前的研究中也发现与NAFLD和肝硬化有关。Faecalibacteriumprausnitzii作为一种有益的肠道共生菌，具有抗炎功能，在一些肠道和代谢疾病中丰度减少，包括炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、结直肠癌(colorectalcancer, CRC)、肥胖、腹腔疾病以及多种病因的肝硬化。在本研究中，Faecalibacterium prausnitzii是区分NAFLD肝硬化和对照组的最关键的有益物种。
宏基因组测序完成了188个单个菌株的鉴定，其中53个菌株在不同组之间的丰度具有差异，以及与临床重要参数之间也具有一定的相关性。其中，Dorea longicatena (GCF_000154065)，在NAFLD肝硬化患者中减少了1.3倍，而Acidaminococcus sp.D21 (GCF_000174215)则富集15倍，二者分别是预测疾病状态的最重要的减少和富集菌株。值得注意的是，NAFLD肝硬化组的Veillonelladispar (GCF_000160015)水平是对照组的8.6倍。此外，有7,355条功能通路被确定，其中39条在NAFLD-肝硬化患者和对照组之间存在差异，包括参与芳香族氨基酸(aromatic amino acids, AAAs)、支链氨基酸(branched chain amino acids, BCAA)、脂肪酸和核苷酸的生物合成(图2A)。与特定微生物物种失调有关通路的关联分析筛选得到了Acidaminococcus和Veillonella，这两种菌都与AAA和BCAA的合成有关。重要的是，这些差异代谢途径还与临床数据相关，并且在来自中国和圣地亚哥的独立队列中一直处于失调状态(图2B)。上述结果表明，NAFLD-肝硬化患者的微生物代谢过程的失调可能是导致疾病进展的原因之一。
图2 肝硬化患者肠道微生物功能途径的改变。(A)使用HUMAnN2工具确定与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照组相关的微生物功能途径，其中包括对微生物基因家族的分析。紫色代表NAFLD-肝硬化组与非NAFLD对照组相比减少的通路。右栏表示该通路在RF模型中的重要性，在关联的色标中，路径重要性由从浅紫色到深紫色的渐变来表示。圆圈表示与差异功能通路显著相关的特定菌属。(B)对来自三个不同数据集的HUMAnN2通路结果进行多变量RV系数分析，这些数据集包括本研究、中国队列和研究者之前的研究。
4 与NAFLD肝硬化相关的代谢物丰度
为了进一步细化疾病特征，研究者量化了NAFLD肝硬化和对照组中435种不同的粪便代谢物的丰度，其中75种与NAFLD肝硬化的临床数据相关(图S5)。接着，研究者利用机器学习和差异丰度相结合的特征选择筛选到17种代谢物，它们相结合能够准确地检测出NAFLD肝硬化(AUC，0.91；图3A，3B)。与此一致，在主成分分析中，这17种代谢物水平可以显著区分NAFLD肝硬化患者和对照组(图3C)。对NAFLD肝硬化预测能力最强的代谢物包括AAA、BCAA、胆汁酸和维生素D的代谢产物，色氨酸和相关代谢物如吲哚和犬尿酸也是代谢组特征中的显著差异物。在NAFL肝硬化患者中，色氨酸(吲哚和吲哚相关化合物)的微生物异化产物增加，而代谢物犬尿酸减少，导致色氨酸水平总体上升(图3A)。NAFLD肝硬化患者中富含亮氨酸和苯丙氨酸衍生物，如亮氨酸-脯氨酸、g-谷氨酰异亮氨酸和谷氨酰苯丙氨酸异构体(图3A)。谷氨酰-苯丙氨酸异构体是主要的差异代谢物，此前有报道称NASH患者的血清样本中谷氨酰-苯丙氨酸异构体升高。研究者认为这些结果是十分有趣的，因为过去的研究表明，肠道中芳香和支链氨基酸的来源会影响肠道通透性、全身免疫和肝脏脂肪变性。
NAFLD肝硬化样本中也富集了C18-鞘氨醇和甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholicacid, GCDCA)(图3A)。有趣的是，GCDCA是法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)的配体，FXR是实验性NASH治疗中的一个重要靶点。此外，NAFLD肝硬化患者的粪便中维生素D及其衍生物减少(图3F)。鉴于维生素D缺乏与包括肝癌在内的许多肿瘤以及肝硬化患者患肝癌的高风险有关，这一发现值得进一步探讨可能的因果关系。
值得注意的是，某些微生物物种(例如Faecalibacteriumprausnitzii, Alistipes putredinis, Eubacterium eligens, 和 Dorea longicatena)以及关键代谢物包括犬尿酸、维生素D3和肠内酯与菌群的a-多样性密切相关，表明这些有差异的物种和代谢物在维持微生物群落丰富度方面具有潜在作用(图3D，3E)。
图3 肝硬化差异代谢物的鉴定。(A) NAFLD-肝硬化组与非NAFLD对照组相比，共鉴定出17种差异代谢物。(B) 使用UCSD队列中17种差异代谢物的RF模型的ROC曲线。(C)使用多变量模型、正交偏最小二乘法(Orthogonal partial least squares,OPLS)对差异代谢物进行识别。(D) NAFLD肝硬化组与非NAFLD对照组相比，维生素D衍生物丰度降低。(E)对物种相对丰度与α-多样性进行Spearman相关分析。(F) 对代谢物与多样性进行Spearman相关分析。
5 NAFLD肝硬化与微生物和代谢物的关系
微生物代谢物与导致NAFLD、IBD和结肠癌的病理生理过程密切相关。在研究中，研究者对关键的差异微生物种类和代谢物进行了的相关分析(图4A)。例如，C18-鞘氨醇水平与Ruminococcus gnavus丰度的增加相关。相反，犬尿酸水平与Faecalibacteriumprausnitzii呈正相关。为了进一步研究互作关系，研究者评估了来自差异物种的基因家族的丰度与关键代谢物水平的关系。由此形成的网络包含33个节点和338条边，代表重要的微生物基因组、元基因组衍生的物种和代谢物(图4B)。
为了部分验证这些联系，研究者试图确认增加的C18-鞘胺醇含量与Ruminococcus gnavus丰度之间的联系(图4A和4B)。在厌氧条件下，鹅去氧胆酸(CDCA)浓度增加的情况下培养Ruminococcusgnavus，以接近NAFLD肝硬化患者体内增加的胆汁酸水平，使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定AAAs和BCAAs等代谢物的含量(图4A和图4B)。同时，C18 -鞘氨醇和1H -吲哚-3-羧醛的含量也随着CDCA浓度的增加而增加(图4C)。图4A和4B的结果表明差异代谢物的产生，认为这是肠道微生物中的变化传递到肝脏的一种可能机制。未来研究的一个重要方向是明确肝病与核心微生物物种和代谢物之间的关系。
6 肝硬化微生物组特征的验证
为了评估宏基因组肠道微生物组特征在肝硬化检测中的潜在作用，研究者在51名非NAFLD、21名无进展纤维化的NAFLD患者、3名NAFLD相关纤维化患者和7名NAFLD-肝硬化患者的一级队列中测试了其用于诊断准确性。在该队列中，微生物组特征与年龄(训练队列中的AUC为0.91)相结合，确定肝硬化的诊断准确率为AUC 0.88(图5A)。随后，研究者在包括各种疾病病因(酒精性肝病、乙型肝炎、丙型肝炎和非酒精性脂肪肝)的已发表队列研究中再次验证了其可用性。使用经训练的模型验证来自意大利队列的数据(46名肝硬化患者和14名年龄匹配的健康对照者的16S rRNA测序数据)，确定肝硬化的诊断准确率为AUC 0.89(图5B)。
同样地，在中国人群(123名患病患者和114名健康对照)中进行的一项定量宏基因组研究的重新分析发现，肝硬化的准确性与该研究发现的“15基因标志物”报告的预测模型准确性接近(AUC分别为0.86和0.84；图5B)。考虑到肝硬化的患者的临床数据，研究者接下来尝试是否可以通过结合BMI和血清标记物(如白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、胆红素、胆固醇、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、葡萄糖、胰岛素和血小板计数)来提高微生物组和年龄特征的诊断准确性。在敏感性分析中，临床参数极大地提高了标志物区分肝硬化的能力。例如，结合当前和中国队列研究中可用的19个差异物种和年龄与血清白蛋白水平，可以将队列中的诊断准确率提高到AUC 0.92。值得注意的是，这种组合特征在该研究的亲属队列和中国队列中都显示出更高的诊断准确性(AUC分别为0.91和0.95；图5C和5D)。鉴于该研究发现的基于联合标志物的临床重要性，该研究接下来进行了敏感性分析，以确定其是否可以区分肝硬化和纤维化。为了探索这种可能性，研究者随访了之前描述的一组经病理活检证实的NAFLD患者，其中包括36名纤维化0期(NAFL)患者，41名纤维化1-3期(轻度/或中度纤维化)患者，以及9名4期纤维化(肝硬化)患者。值得注意的是，该模型能够区分肝硬化与NAFL和轻度或中度纤维化(AUC分别为0.85和0.84；图5E和5F)。此外，纳入肝硬化患者中升高的血清AST水平，既提高了UCSD队列中标志物的准确性，也显著提高了其区分肝硬化与NAFL和纤维化的能力(AUC分别为0.94和0.91；图5G和5H)。为了进一步检查特定微生物物种丰度的变化，研究者还增加了从目前的研究到该团队先前发表的0-4期非酒精性肝硬化患者队列中的27例患者。在NAFL、轻度或中度纤维化和肝硬化组(图5I和5J)中，可以看到单个标志性物种的相对丰度发生显著变化。这种基于肠道微生物组的特征在地域和文化上不同的人群中以及在混合性纤维化患者中的稳定性，证明了其可以作为肝硬化检测的一种潜在的诊断方法。
图5 肝硬化粪便样本宏基因组机器学习RF模型的验证. (A) 在UCSD NAFLD相关肝硬化患者亲属队列中使用19个不同物种和年龄对RF模型进行验证。ROC曲线显示RF模型在队列中识别肝硬化的诊断准确性，其准确率为AUC0.88。(B)在地域独立的肝硬化患者队列中对RF模型进行外部验证。ROC曲线显示RF模型在中国(123名肝硬化患者和114名对照)和意大利(35名肝硬化和14名对照)队列中识别肝硬化的诊断准确性。19种鉴别的种类和年龄确定了多种病因的肝硬化，准确率很高。中国队列(红线)的AUC为0.86, 意大利队列(绿线) AUC为0.89。(C和D)使用UCSD亲属和中国队列中的19个鉴别物种、年龄和血清白蛋白对RF模型进行验证。ROC曲线显示结合了19种微生物种类、年龄和血清白蛋白评分的RF模型识别肝硬化的诊断准确性。(E和F)在先前描述的混合性肝纤维化队列中，基于微生物标志物区分肝硬化和纤维化的准确性。ROC曲线显示了结合19种微生物种类和年龄的RF模型在混合纤维化阶段(0期[NAFL，N=36]；1-3期[MID纤维化，N=41]；4期[肝硬化，N=9])队列患者中识别肝硬化的诊断准确性。(G和H)在混合队列中，包括血清肝损伤标记物AST对区分肝硬化和纤维化的准确性的影响。(I和J) 随疾病进展而变化的差异微生物种类的相对丰度。来自当前NAFLD-肝硬化研究(27例肝硬化)的数据与(E和F)中描述的混合纤维化队列相结合。
结论
该研究证明了核心肠道微生物组特征可以在不同地域的队列中识别肝硬化，并且独立于疾病病因以及宿主遗传学和环境因素对肠道微生物组的影响。该研究挖掘的微生物组衍生的诊断标志物的普遍适用性表明，其中的关键微生物物种可能在肝硬化的病理生理学中起到因果作用。事实上，在所有3项肝硬化研究中，患者体内的几种Veillonella species的丰度都发生了改变。为了进一步支持潜在的因果关系，代谢物衍生的特征能够实现类似的诊断准确性，并且与微生物衍生的标志物之间有着显著的相关性。此外，包括色氨酸、亮氨酸衍生物和犬尿酸在内的几种标志性代谢物的水平也发生了变化，这表明微生物AAA和BCAA合成的失调可能会影响肝脏生物功能。
评论
NAFLD是指除酒精以外所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。与病毒性或酒精性脂肪性肝硬化不同，NAFLD肝硬化是一种持续性的代谢性损害的慢性累积，而不是外部损害。研究发现与肝硬化广泛相关的微生物代谢产物，表明了在慢性肝脏损伤反应中未被认识到的共性问题。肝硬化性肝损伤的严重程度可能导致肠道微生物的失调，因此，对单一病因的队列进行进一步研究以区分这种可能性是十分有必要的。
研究表明，与健康人相比，慢性肝病患者的肠道菌群结构发生了显著变化，这使得利用菌群的变化来开发无创诊断工具成为可能。来自加州大学圣地亚哥分校的研究人员从患者的肠道微生物中识别出一类标志物，该类群在来自不同种族和地理位置的患者中检测到由多种原因引起的肝硬化。此外，这个基于微生物组的诊断工具可以区分从纤维化进展到肝硬化的患者。这项研究表明，微生物类群用于肝硬化患者的诊断具有临床和广泛的实用价值，并强调了特定的细菌种类作为新的治疗方法的潜在靶点。因此，该研究的多组学分析也为为未来研究肝硬化发生和发展中关键微生物种类及其代谢物之间的因果关系提供了参考。
然而，该研究目前也存在一些局限性，包括实验人群队列的规模相对较小，代偿和失代偿病例之间缺乏区分，以及在意大利和中国的验证队列中获得必要临床参数的机会有限。此外，该研究中确定的微生物种类与肝硬化之间的关联并没有显示出明显的因果关系。此外，仍然需要对表型特征明显的混合期肝纤维化患者进行多中心研究，以进一步验证研究结果。
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