最近师弟师妹们走进了实验室，对一些“看似复杂”的计算问题有些抓瞎，马上要离校了，为你们做一个最后的整（Gan）理（Huo），将Western Blot（简称WB）实验的蛋白浓度定量和计算上样体积的方法写在这里，希望能给你们提供一些帮助。
WB实验的成败在每个细节里，最开始的也是最重要的。蛋白定量的方法有很多种，基本上都是“用已知求未知”的方法，在这里主要介绍的是BCA蛋白浓度定量的方法。拿到BCA蛋白定量试剂盒后按照说明书，准备好所需要的东西，按照步骤一一加入，最后的Cu（绿色试剂）按最快的速度加，有条件的可以用排枪加，这时会看到有些孔的颜色会呈深紫色、紫色、淡紫色、淡绿色等，这里可以大致用肉眼估计一下样品的浓度差异，A孔是标孔中浓度最高的，所以样品孔中的颜色不能比A孔的颜色深，按照说明书规定的时间完成所需操作，放入酶标仪，测出吸光度（OD值）。需要补充的是标准品（A-I）需要加三排复孔，求平均值后拟合线性方程（我做了一排，你们再做时要做三排哦
）。
图1 96孔板加样后(原则上酶标板的板底是不能用手去触碰的，一般拿的是侧壁)
图2 酶标仪测出的OD值
原谅我96孔板位置放反了
，酶标仪这个图片大家旋转180°看，A-I是试剂盒中标准品各浓度的OD值，a-e是样品（组织抽提的上清液和试剂的混合液体），为避免误差影响需加3个复孔，这里我做示范列2个复孔。如果你所用的酶标仪可以加标曲，设置添加趋势线、公式和R²。如果只有上图这些数字，也不慌张，我们可以用神奇的EXCEL表格绘制标曲。
首先，先告诉大家为什么要制作标曲。试剂盒中提供了标准品，并按照不同的稀释比例有对应的浓度，A-I的浓度和OD值都是已知的，所以根据已知的数据可以得出A-I形成的趋势线公式，R²要为0.99，无限趋近于1。刚才所说的样品孔的颜色不能比A孔深，原因就在这里，这条趋势线的公式只适用于≥I孔和≤A孔区间范围内的所有OD值，这就是通过已知的标曲的趋势线公式，求未知的样品浓度。
接下来，教大家如何绘制趋势线得出公式：
1.用鼠标左键选中A-I的吸光度和浓度（只选数字），这里请注意，原则上讲，标准线需要三个复孔求平均值后拟合线性方程
图3 标准品OD值和浓度
2.点插入图表，选中XY（散点图）中的第一个图
图4 插入xy散点图
3.选中生成的图表任意一个蓝点，点击右键，选中添加趋势线
图5 选择添加趋势线
4.勾选“线性”“显示公式”“显示R平方值”
图6 设置趋势线选项
5.然后就得到了这样一张图表，X轴是OD值，纵轴是浓度，图表的右上方是R²=0.9937，公式是可以用的，所以样品孔浓度就可以用这个公式计算
图7 生成图表
接下来就可以用EXCEL表格计算蛋白浓度和上样体积了。
方法1
图8 根据不同浓度计算得出不同上样体积
图注：
1.平均值是复孔1和复孔2的总和除以2；
2.将算出的OD平均值（x）代入y=1196.1x-179.87，计算出样品孔的浓度（y）；
3.如果在测OD值时，样品孔的OD值大于A孔的OD值，就说明样品孔的浓度偏大（不能代入公式计算浓度），需要成倍稀释后再次测OD值，直到测得的样品OD值在I-A范围之间，即可代入公式计算浓度。根据经验，4°离心后的上清液颜色如果偏黄，蛋白浓度一般很大，需要稀释，蛋清色的上清会比偏黄色的上清浓度略低，所以建议加到96孔板里的蛋白上清液最好稀释一定比例，避免返工。这一步适用于加了稀释液、浓度偏大的样品，在得出y的基础上乘以稀释倍数，得到蛋白的真正浓度；
4.因为标准品的浓度单位是μg/ml，而后面的上样体积单位为μl，所以换算成μg/μl；
5.上样时不单单是蛋白上清液，还要加入成比例的上样缓冲液，这里以5X上样缓冲液为例（4μl的蛋白上清配1μl的上样缓冲液，4:1的关系），所以这一步的上样浓度就变成：蛋白浓度（μg/μl）乘以0.8；
6.上样的总量是一定的，可以是30μg，也可以是50μg，这个值可以通过曝光后条带的颜色深浅来改变总量的多少。上样体积就是上样总量÷上样浓度，这样就算出来每组样品需要加多少μl的上样体积跑胶啦。还有一点要注意的是，如果样品的浓度很低，测出来的体积就会大，因为一个梳子孔最多能注入25μl，尽量不要超过20μl为好，否则跑出来效果不佳。
此方法的优点是计算简单、易懂，缺点是上样时需不断调枪，蛋白需求量大。
方法2
例如现在已经算出5组蛋白的浓度，如下图：
图9 已算出蛋白浓度的5组数据
这里所得出的浓度是蛋白的真正浓度（没有加入上样缓冲液），为了使5组样品浓度达到一致，需要加入不同体积的稀释液（用提蛋白的裂解试剂液），以达到等体积上样的目的。稀释的浓度必须是比5组蛋白浓度要更低的一个数值，这里最低是6.99μg/μl，所以我们选择统一稀释到5μg/μl，如果一个样制备100μl的体积，这个小离心管里的终浓度就为5μg/μl×100μl=500μg。总体积100μl包括：①样品（上清+稀释液）（80μl）②上样缓冲液（20μl），①中的上清体积=终浓度500μg÷对应蛋白浓度μg/μl，稀释液体积=80μl-上清体积。这样就算出来需要加多少蛋白上清和稀释液了。
图10 计算所需上清体积和稀释液体积
以这种方法制备的样品上样体积是一定的，可以统一为5μl、8μl、10μl、15μl等。此方法的优点是不用反复调枪，上样体积均匀一致，缺点是计算复杂，需要再次加入试剂。
以上是WB实验蛋白定量和计算上样体积常用的两种方法。整个实验过程，有些可以粗，有些必须细，实验结果的完美呈现，都是在一次次失败中总结出来的，失败并不可怕，而是上天又赋予你一次改进的机会，心里要时刻准备接受失败，耐心和毅力是陪伴你的实验伙伴，Good Luck！
最后特别感谢医学实验中心李倩老师、王冲老师，王萌博士，唐梦凡、谭福红、芮冉、杨柳笛同学对本次实验的帮助，以及对本文的修正。
本文经授权转载自公众号晨蕾
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